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Biochemistry

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Abstract

Las lipoproteínas de proteobacterias son modificadas postraduccionalmente por ácidos grasos derivados de fosfolípidos de membrana por la acción de tres enzimas integrales de membrana, lo que resulta en proteínas triaciladas. El primer paso en la vía de modificación de la lipoproteína implica la transferencia de un grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína, lo que resulta en la prolipoproteína diacilglicerilo. En el segundo paso, el péptido señal de la prolipoproteína se escinde, formando una apolipoproteína, que a su vez es modificada por un tercer ácido graso derivado de un fosfolípido. Este último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt). La vía de modificación de lipoproteínas es esencial en la mayoría de las γ-proteobacterias, por lo que es un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos. Aquí se describe un ensayo sensible para Lnt que es compatible con el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas inhibidoras. La enzima y los sustratos son moléculas incrustadas en la membrana; Por lo tanto, el desarrollo de una prueba in vitro no es sencillo. Esto incluye la purificación de la enzima activa en presencia de detergente, la disponibilidad de sustratos de péptidos alquinos-fosfolípidos y diacilglicerilo, y las condiciones de reacción en micelas mixtas. Además, para utilizar la prueba de actividad en una configuración de cribado de alto rendimiento (HTS), se prefiere la lectura directa del producto de reacción sobre las reacciones enzimáticas acopladas. En este ensayo enzimático fluorométrico, el producto peptídico alquino-triacilado se vuelve fluorescente a través de una reacción de química de clic y se detecta en un formato de placa de múltiples pocillos. Este método es aplicable a otras aciltransferasas que utilizan sustratos que contienen ácidos grasos, incluidos los fosfolípidos y el acil-CoA.

Introduction

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por ácidos grasos unidos covalentemente en sus aminoácidos a través de los cuales se anclan en membranas 1,2. La parte madura de la proteína es muy diversa en estructura y función, lo que explica el papel de las lipoproteínas en diversos procesos biológicos en la envoltura celular bacteriana.

Las lipoproteínas son modificadas por ácidos grasos derivados de fosfolípidos después de la inserción en la membrana citoplasmática. Las prolipoproteínas contienen un motivo característico, el lipobox, que contiene un residuo de cisteína invariante que se acila y el primer aminoácido en la proteína madura. El primer paso de esta vía es catalizado por la prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacilgliceril transferasa (Lgt), que transfiere el grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína a través de un enlace tioéter entre diacilglicerilo y cisteína. La peptidasa señal II (Lsp) escinde el péptido señal de la prolipoproteína diacilglicerilo, lo que resulta en una apolipoproteína que se ancla en la membrana a través de su fracción diacilglicerilo. El tercer y último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt), que agrega un ácido graso de la posición sn-1 del fosfolípido a la apolipoproteína, lo que resulta en una lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. La reacción Lnt es una reacción de ping-pong de dos pasos donde se forma un intermediario de enzima acilo tioéster estable. El subproducto lisofosfolípido se libera antes de la acilación del sustrato de apolipoproteína en el segundo paso de la reacción.

La especificidad del sustrato de fosfolípidos se determina en un ensayo Lnt basado en el cambio de movilidad del péptido N-acil diacilglicerilo en un alto porcentaje de Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Los fosfolípidos con pequeños grupos polares, saturados [sn-1] y no saturados [sn-2], fueron sustratos preferidos 4. El ensayo de desplazamiento de gel no es apropiado para estudios cinéticos extensos de apolipoproteína N-aciltransferasa ni para HTS para identificar moléculas inhibidoras. La química de clics utilizando ácidos grasos alquinos se ha utilizado con éxito para estudiar la modificación de lipoproteínas en bacterias5 y el metabolismo de ácidos grasos en eucariotas6. Recientemente, se informó de un ensayo in vitro de palmitoilación de Ras para identificar inhibidores7.

En el método descrito aquí, el Lnt activo purificado en detergente se incuba con sustratos en micelas mixtas para formar un péptido alquino-triacilado que posteriormente se detecta mediante espectrometría de fluorescencia.

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Protocol

1. Preparación de enzimas y sustratos

  1. Purificación de la enzima
    1. Producir y purificar la enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas detergentes como se describió anteriormente 4,8. Brevemente, inducir la expresión del gen lnt-estreptococo, codificando Lnt con una etiqueta de estreptococo C-terminal, en OD 600 de 0,6 con tetraciclina anhidra (200 ng/mL) a 37 °C durante 16 h.
    2. Recolectar células por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
    3. Resuspender el pellet celular en tampón WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) a 100 OD600 unidades por mL.
    4. Rompa las celdas en dos pasajes a través de una prensa de celda de presión francesa a 10,000 psi.
    5. Eliminar las células intactas y los residuos por centrifugación a 13.000 x g durante 20 min. Conservar el sobrenadante y desechar la bolita.
    6. Centrifugar el sobrenadante a 120.000 x g durante 60 min y recoger las vesículas de membrana (pellet translúcido de color marrón). Deseche el sobrenadante.
    7. Solubilizar las proteínas integrales de membrana del pellet de membrana con 1% (p/v) de n-dodecil β-D-maltósido (DDM) en tampón WA durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar y eliminar el material insolubilizado a 120.000 x g durante 30 min. Utilice la fracción sobrenadante para la purificación.
    8. Purificar Lnt-strep en una columna de cromatografía de afinidad (ver Tabla de materiales) y una columna de filtración de gel S400 (ver Tabla de materiales) como se describe en Nozeret et al.8.
    9. Almacene la enzima purificada en un tampón WA que contenga 0,05% de DDM y 10% de glicerol a -80 °C.
      NOTA: La enzima es estable durante más de 5 años.
  2. Preparación de sustratos de ligando estimulante de fibroblastos alquinos-fosfolípidos y biotinilados (FSL-1-biotina)
    1. Alícuota 100 μL de alquino-POPE sintetizado a medida (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ver Tabla de materiales) solubilizado en cloroformo en tubos de 1.5 mL.
    2. Perforar los tubos con una jeringa y evaporar el cloroformo en una velocidad de aspiración a RT durante 2 h. Conservar las muestras secas de fosfolípidos a -20 °C.
    3. Disuelva el alquino-POPE en Triton X-100 al 0,1% a 500 μM antes de su uso. Agregue un paso de sonicación de 3 minutos en un baño de agua ultrasónico en RT para solubilizar alquino-POPE si es necesario.
    4. Resuspender FSL-1-biotina en agua a 445 μM.
      NOTA: Ambas soluciones pueden conservarse a -20 °C durante al menos 2 meses.

2. Ensayo de tubo

NOTA: El día 1, configure la reacción Lnt en tubos de 1,5 ml (paso 2.1) y cubra las placas de 96 pocillos con estreptavidina (paso 2.2).

  1. Preparación de mezcla de reactivos y reacción enzimática
    1. Para un ensayo Lnt estándar, mezclar alquino-POPE (50 μM finales de 500 μM de stock) y FSL-1-biotina (concentración final de 50 μM de un stock de 445 μM) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 que contiene 1% BSA) a un volumen final de 18 μL en tubos de 1.5 mL. Realizar todas las condiciones por triplicado.
    2. Sonicar la mezcla de sustrato (preparada en el paso 2.1.1) durante 3 min en un baño maría ultrasónico e incubar a 37 °C durante 5 min antes de añadir la enzima Lnt (paso 2.1.3).
      NOTA: MTSES (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate de sodio), un reactivo específico de tiol, inhibe Lnt8. Añadir 10 mM MTSES (solución madre de 100 mM en DMSO al 100%) a los tubos de reacción (paso 2.1.1) para utilizarlos como muestras de control negativo. Ajuste el volumen del tampón de reacción Lnt para que el volumen total sea de 18 μL.
    3. Añadir Lnt activo (1 ng/μL, correspondiente a 17,2 nM) o inactivo Lnt (C387S) (2 μL de material de 10 ng/μL en tampón WA que contenga 0,05% DDM) y mezclar con los sustratos (paso 2.1.2) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    4. Incubar la reacción a 37 °C durante 16 h en un termomezclador con tapa calentada.
  2. Recubrimiento de estreptavidina de placas de 96 pocillos
    1. Preparar una solución madre de estreptavidina a 2 mg/ml enH2O.
      NOTA: Esta solución puede conservarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
    2. A partir de la solución madre, prepare 10 μg / ml de estreptavidina en agua como solución de trabajo. Añadir 100 μL de la solución a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Unir la estreptavidina a la placa incubando a 37 °C durante la noche sin tapa para secar al aire los pocillos.

NOTA: El día 2 realice química de clic (paso 2.3), una la mezcla de reacción Lnt a las placas recubiertas de estreptavidina (paso 2.4) y detecte fluorescencia y analice los resultados (paso 2.5).

  1. Reacción química de clic
    1. Preparar soluciones madre de Azido-FAM (5 mM en DMSO), TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; 50 mM preparado en agua), TBTA (Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 2 mM en terc-butanol:DMSO (4:1)), y CuSO4∙5H2O (50 mM recién preparado enH2O).
    2. En los tubos de 1,5 ml que contienen la mezcla de reacción Lnt preparada en el paso 2.1.4, realice la química de clic añadiendo los reactivos en el siguiente orden: 0,2 μL de azido-FAM madre (concentración final 50 μM), 0,4 μL de TCEP madre (concentración final 1 mM), 0,2 μL de TBTA madre (concentración final 0,02 mM).
    3. Vórtice la solución durante 5 s. A continuación, añadir 0,4 μL de CuSO4 (concentración final de 1 mM). Vórtice de nuevo durante 5 s. Incubar las muestras en la oscuridad a RT durante 1 h.
  2. Unión de la mezcla de reacción Lnt a placas recubiertas de estreptavidina
    1. Lave los pocillos de las placas recubiertas de estreptavidina después de la incubación durante la noche a partir del paso 2.2.2 3x con 200 μL de PBS-T1 (PBS que contiene 0,05% de Tween-20).
      NOTA: Las placas de estreptavidina pueden utilizarse inmediatamente o conservarse secas a 4 °C.
    2. Transfiera 18 μL de la mezcla de química de clic del paso 2.3.3 a un pocil en una placa recubierta de estreptavidina de 96 pocillos y agregue 100 μL de PBS-T1 para unir el producto N-acil-FSL-1-biotina-FAM a las placas de estreptavidina.
    3. Utilice biotina-fluoresceína (0,26 μM de un stock de 3,1 mM en DMSO) como control positivo para la unión a estreptavidina y la lectura de fluorescencia.
    4. Incubar las placas a RT durante 1 h en la oscuridad en un termomezclador, agitando a 300 rpm.
    5. Realice los pasos de lavado manual de las placas de 96 pocillos con una pipeta electrónica multicanal de la siguiente manera: seis lavados con 200 μL de PBS-T2 (PBS que contiene 1% de Tween-20), tres lavados con una pipeta, tres lavados con 200 μL de PBS, tres lavados con una pipeta.
  3. Detección y análisis de fluorescencia
    1. Agregue 200 μL de PBS y registre la fluorescencia a 520 nm en un lector de microplacas de fluorescencia. Guarde los resultados en el software de hoja de cálculo.
      NOTA: La biotina-fluoresceína se utiliza como control positivo para la unión a estreptavidina y la detección de fluorescencia a 520 nm. Se espera una lectura reproducible de 30.000-40.000 U.A. con 0,26 μM de biotina-fluoresceína. Todas las muestras se analizan por triplicado, incluidos los controles.
    2. Calcule la desviación estándar para cada reacción y calcule los valores P para controles negativos y muestras positivas utilizando la prueba t no pareada utilizando un software estadístico.

3. Ensayo de placa multipocillo

NOTA: El día 1 configurar la reacción Lnt en placas de 384 pocillos (paso 3.1) y cubrir 384 placas de pocillos con estreptavidina (paso 3.2).

  1. Preparación de mezcla de reactivos y reacción enzimática
    NOTA: La cantidad de reactivos y enzimas se reduce en comparación con el ensayo de tubo y la reacción Lnt se realiza directamente en 384 placas de pocillos. Esto permite el uso de menos material y una reducción de pasos que pueden automatizarse aún más.
    1. Mezclar los sustratos de la siguiente manera: alquino-POPE (concentración final 50 μM de 500 μM stock) y FSL-1-biotina (50 μM finales de 500 μM stock) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 que contiene 1% BSA) a un volumen de 13.5 μL por reacción por pozo en un formato de placa de 384 pocillos. Realizar todas las condiciones por triplicado. Calcule la cantidad total de reactivos necesarios para el número de reacciones a realizar (es decir, 5.184 μL para una placa de 384 pocillos).
    2. Sonicar la mezcla de sustrato durante 3 minutos en un baño de agua ultrasónico.
    3. Alícuota 13,5 μL de la mezcla de sustrato por pocillo en una placa de 384 pocillos.
      NOTA: Como control negativo, se pueden agregar 10 mM de MTSES (solución madre de 625 mM en DMSO al 100%) por pocillo. Ajustar el volumen del tampón Lnt (paso 3.1.1) para alcanzar un volumen de reacción final de 13,5 μL.
    4. Incubar a 37 °C durante 5 min antes de la adición de la enzima Lnt (paso 3.1.5).
    5. Añadir 0,5 ng/μL (correspondiente a 8,6 nM) de enzima Lnt activa, o variante inactiva (C387S) (1,5 μL de 5 ng/μL en tampón WA que contiene 0,05% de DDM) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) a cada pocillo que contenga la mezcla de reacción del paso 3.1.3. Mezclar los reactivos pipeteando hacia arriba y hacia abajo. El volumen total de reacción es de 15 μL.
    6. Selle la placa con lámina de plástico para placas de pocillos múltiples.
    7. Incubar a 37 °C durante 16 h en un termomezclador con tapa calentada.
  2. Recubrimiento de estreptavidina 384 placas de pocillos
    1. Utilizar 75 μL de estreptavidina (10 μg/ml enH2O) a partir del paso 2.2.2 para recubrir los pocillos de una placa de 384 pocillos. Deje que la estreptavidina se una a la placa incubando a 37 °C durante la noche sin tapa para secar al aire los pocillos.

NOTA: El día 2, realice la química de clic (paso 3.3), una la mezcla de reacción Lnt a las placas recubiertas de estreptavidina (paso 3.4), detecte fluorescencia y analice los resultados (paso 3.5).

  1. Reacción química de clic
    1. Preparar soluciones madre de Azido-FAM (1,2 mM en DMSO), TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; 24 mM preparado en H2O), TBTA (Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 0,48 mM en terc-butanol:DMSO (4:1)) y CuSO4∙5H2O(24 mM recién preparado enH2O).
    2. Combine los tres reactivos de química de clic: una mezcla de Azido-FAM (concentración final 50 μM), TCEP (1 mM final) y TBTA (0,02 mM final), cada uno a 0,75 μL en volumen final de 2,25 μL por pocillo. Calcule el volumen requerido por placa de 384 pocillos (es decir, use 864 μL cuando se usen todos los pocillos de la placa de pocillos 384). Mezclar vigorosamente.
    3. Añadir 2,25 μL de la solución reactiva por pocillo directamente a la reacción Lnt completada en la placa de 384 pocillos del paso 3.1.7.
    4. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica multicanal.
    5. Añadir CuSO4 (0,75 μL de material de 24 mM para una concentración final de 1 mM) y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica multicanal.
    6. Incubar a RT durante 1 h en la oscuridad.
  2. Unión de la mezcla de reacción Lnt a placas de 384 pocillos recubiertas con estreptavidina
    1. Lavar los pocillos de las placas recubiertas de estreptavidina después de la incubación nocturna a partir del paso 3.2.1 1x con 85 μL PBS-T1.
    2. Transfiera 11 μL de la reacción química de clic de cada pocillo de la placa de incubación del paso 3.3.6 a la placa recubierta de estreptavidina del paso 3.4.1 para unir el producto N-acil-FSL-1-biotina-FAM a las placas de estreptavidina.
    3. Añadir 64 μL de tampón PBS-T1.
    4. Incluir biotina-fluoresceína (0,19 μM de un stock de 3,1 mM en DMSO) como control para la unión a pocillos recubiertos de estreptavidina.
    5. Incubar las 384 placas de pocillos a RT durante 1 h en la oscuridad en un termomezclador, agitando a 300 rpm.
    6. Lave las placas con una lavadora automática de placas de la siguiente manera: 10 lavados con 85 μL PBS-T2, las placas se agitan entre lavados; 5 lavados con 85 μL PBS, las placas se agitan entre lavados.
  3. Detección y análisis de fluorescencia
    1. Agregue PBS (85 μL) y registre la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia a 535 nm.
    2. Analice los datos como se describe (paso 2.5.2).

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Representative Results

En la reacción Lnt, el ácido graso sn-1 de los fosfolípidos se transfiere a un péptido diacilglicerilo, lo que resulta en un péptido triacilado maduro8. El ensayo Lnt in vitro descrito aquí está diseñado para utilizar fosfolípidos que contienen un ácido graso alquino (alquino-POPE) y FSL-1-biotina como sustratos, lo que resulta en la formación de alquino-FSL-1-biotina. Tras una reacción química de clic con azido-FAM, este producto debe marcarse fluorescentemente y detectarse mediante espectrometría de fluorescencia (Figura 2).

Las condiciones de reacción se optimizaron para una lectura de fluorescencia máxima a 520 nm en un lector de placas. A 1 ng/μL de enzima, se observó conversión completa de FSL-1-biotina8 (Figura 3). Los controles negativos incluyeron reacciones sin enzima, con una variante inactiva de la enzima (mutante de sitio activo C387S), o con el inhibidor específico de tiol MTSES que resulta en una detección de baja fluorescencia. La biotina-fluoresceína se unió eficientemente a las placas recubiertas de estreptavidina y se utilizó como control interno para la señal de fluorescencia máxima. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y cálculos de desviación estándar y el análisis estadístico mostró que el ensayo era sensible y reproducible.

Para desarrollar un ensayo HTS para detectar inhibidores de moléculas pequeñas de Lnt, se redujo la cantidad de reactivos y las reacciones se realizaron directamente en 384 placas de pocillos. Además, los pasos de lavado se automatizaron utilizando una lavadora de placas (ver Tabla de materiales). En cuanto al ensayo en tubo, la reacción fue sensible y reproducible, con una diferencia significativa entre el control negativo (C387S) y la enzima activa (Lnt) (Figura 4). En HTS, el factor Z' determina si una respuesta en un ensayo es lo suficientemente grande para fines de detección9 y se calcula utilizando la siguiente ecuación:

Equation 1

Donde S es la señal promedio, B es la señal de fondo y σ es la desviación estándar.

El factor Z' promedio fue de >0,6 para el ensayo Lnt realizado en formato HTS utilizando 384 placas de pocillos, lo que sugiere que el ensayo para el cribado de moléculas pequeñas para la inhibición de Lnt fue sobresaliente.

Figure 1
Figura 1: Reacciones enzimáticas en la modificación postraduccional de lipoproteínas en proteobacterias. Los pasos secuenciales fueron catalizados por Lgt10, Lsp 11 y Lnt12,13,14 en la membrana citoplasmática. PGN: peptidoglicano, SP: péptido señal, LB: lipobox, motivo conservado que contiene Cys+1 y modificado con ácidos grasos y el primer aminoácido en lipoproteína madura, PG: fosfatidilglicerol, G-1-P: glicerol-1-fosfato, PE: fosfatidiletanolamina, lisoPE: liso-fosfatidiletanolamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del ensayo enzimático fluorométrico para la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt). Los sustratos FSL-1-biotina (amarillo) y alquino-POPE (azul) se mezclaron con la enzima Lnt purificada solubilizada en detergente. La reacción se realizó en micelas mixtas a 37 °C (paso 1). El producto alquino-FSL-1-biotina se etiquetó con fluoresceína (naranja) mediante química de clic (paso 2) y se detectó en un lector de placas de fluorescencia al unirse a placas recubiertas de estreptavidina (paso 3). La figura es una versión modificada de la Figura 1B publicada por Nozeret et al.8 según la licencia Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Detección fluorescente de actividad Lnt en formato de 96 pocillos. Las reacciones Lnt se realizaron en tubos a 37 °C durante 16 h. Después del etiquetado fluorescente por química de clic y la unión a placas recubiertas de estreptavidina, la fluorescencia se midió mediante espectrometría de fluorescencia. La biotina-fluoresceína (biotina-fluo 0,26 μM) se utilizó como control para la fluorescencia. El tampón era solo un tampón de reacción. Las muestras que indicaban alquino-POPE (50 μM), FSL-1-biotina (50 μM) y sustratos (mezcla de alquino-POPE y FSL-1-biotina, 50 μM cada uno) no contenían enzima. Los controles negativos incluyeron inhibición con MTSES (10 mM) y una variante inactiva de Lnt (C387S). Se añadió la enzima Lnt a 1 ng/μL. Se calcularon desviaciones estándar para n = 3 experimentos. ** El valor p < 0,005. Excitación a 494 nm, ancho de banda 5 nm y emisión a 520 nm, ancho de banda 5 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Lectura de fluorescencia de la reacción Lnt en placa de 384 pocillos compatible con HTS. Las reacciones enzimáticas de Lnt se realizaron en 384 placas de pocillos a 37 °C. La biotina-fluoresceína (biotina-fluo 0,19 μM) se utilizó como control para la fluorescencia. El tampón era un tampón de reacción que contenía DMSO. Los controles negativos incluyeron inhibición con MTSES (10 mM) y una variante inactiva de Lnt (C387S). Se añadió la enzima Lnt a 0,5 ng/μL. Se calcularon las desviaciones estándar para n = 3 experimentos. El valor p < 0,0005. Excitación a 485 nm, ancho de banda 20 nm y emisión a 535 nm, ancho de banda 25 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo para el ensayo Lnt descrito aquí, basado en la detección de fluorescencia del producto triacilado, es sensible y reproducible. La unión específica y eficiente de la biotina a la estreptavidina es un elemento clave en el ensayo. El sustrato de alquino-papa que queda después de completar la reacción Lnt también se marca fluorescentemente con FAM, pero se elimina de manera eficiente después de unirse a las placas de estreptavidina mediante múltiples pasos de lavado. Además, la adición de DMSO no afecta la actividad de Lnt y no tiene ningún impacto en el ensayo. Tanto el sustrato como la enzima son altamente lipofílicos y requieren condiciones de reacción en micelas mixtas. Las técnicas que dependen de enzimas solubles y sustratos para la detección de productos, incluida la polarización de fluorescencia, no son aplicables8. La única limitación del ensayo es la compatibilidad de la enzima con el sustrato alquino, porque la reacción química de clic depende de este grupo químico.

Los ensayos de cambio de gel han sido reportados en estudios previos para analizar la actividad de Lnt y para determinar la especificidad del sustrato4. Con el protocolo actual, y en paralelo con la espectrometría de fluorescencia, la detección de fluorescencia en gel se puede utilizar para monitorear la actividad Lnt8, aunque este formato no es adecuado para HTS. El ensayo de tubo es particularmente interesante para estudios cinéticos y comparativos de mutantes Lnt. La especificidad del sustrato de fosfolípidos puede abordarse utilizando alquinos-fosfolípidos obtenidos por marcaje metabólico de bacterias con ácidos grasos alquinos compuestos de varias longitudes de cadena y grado de saturación como se describe8.

El formato de placa de 384 pocillos es compatible con los estudios HTS porque se observa una diferencia significativa entre la enzima activa y un control de sustrato solo. Se calculó un factor Z' promedio de >0.6 con las condiciones optimizadas presentadas aquí. La alta reproducibilidad del ensayo contribuye al alto factor Z'. Para una HTS exitosa, se recomienda un factor Z' superior a 0,69. Los pasos de lavado son eficientes con el uso de una lavadora de placas automatizada. Otros pasos pueden optimizarse aún más, incluido el pipeteo de reactivos, lo que permitiría el cribado de grandes bibliotecas de moléculas pequeñas.

El protocolo es aplicable a otras aciltransferasas que utilizan sustratos que contienen ácidos grasos si los grupos alquinos son compatibles con el reconocimiento del sustrato por la enzima. Un estudio reciente sobre la identificación de inhibidores específicos de la palmitoil acil transferasa eucariota (PAT) describe el uso de enzimas unidas a la membrana y alquino-acil-CoA como sustrato7. La palmitoilación de un pequeño péptido Ras biotinilado se observó mediante detección fluorogénica por química de clic. Una pantalla piloto en formato de placa de 384 pocillos de este ensayo identificó inhibidores específicos de PAT, lo que sugiere que los sustratos compuestos de grupo de ácidos grasos alquinos combinados con química de clics y detección de fluorescencia sensible es un método prometedor para HTS basado en objetivos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Fabrice Agou y Alix Boucharlat de la Plataforma de Detección Quimiogenómica y Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Investigación (C2RT) en el Instituto Pasteur de París por sus útiles sugerencias sobre el protocolo, a todos los miembros de la Unidad BGPB por el apoyo y las discusiones científicas, y a Simon Legood por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue financiado por Global Care Initiatives del Instituto Carnot de Enfermedades Infecciosas y el Instituto Carnot Microbios y Salud (15 CARN 0017-01 y 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

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References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

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Bioquímica Número 159 apolipoproteína de membrana integral N-aciltransferasa péptido diacilglicerilo alquino-fosfolípido micelas mixtas química de clics fluorescencia
Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento
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Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

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