Summary
Здесь представлен чувствительный флуоресцентный анализ для мониторинга активности аполипопротеина N-ацилтрансферазы с использованием диацилглицерилпептида и алкин-фосфолипидов в качестве субстратов с клик-химией.
Abstract
Липопротеины из протеобактерий посттрансляционно модифицируются жирными кислотами, полученными из мембранных фосфолипидов под действием трех интегральных мембранных ферментов, в результате чего образуются триацилированные белки. Первый этап в пути модификации липопротеинов включает перенос диацилглицерильной группы из фосфатидилглицерина в пролипопротеин, что приводит к диацилглицериловому пролипопротеину. На второй стадии сигнальный пептид пролипопротеина расщепляется, образуя аполипопротеин, который в свою очередь модифицируется третьей жирной кислотой, полученной из фосфолипида. Эта последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt). Путь модификации липопротеинов имеет важное значение в большинстве γ-протеобактерий, что делает его потенциальной мишенью для разработки новых антибактериальных агентов. Здесь описан чувствительный анализ для Lnt, который совместим с высокопроизводительным скринингом малых ингибирующих молекул. Фермент и субстраты представляют собой мембранно-внедренные молекулы; поэтому разработка теста in vitro не является простой. Это включает в себя очистку активного фермента в присутствии моющего средства, наличие алкин-фосфолипидов и субстратов диацилглицерильных пептидов, а также условия реакции в смешанных мицеллах. Кроме того, чтобы использовать тест активности в высокопроизводительной системе скрининга (HTS), прямое считывание реакционного продукта предпочтительнее связанных ферментативных реакций. В этом флуорометрическом ферментном анализе алкин-триацилированный пептидный продукт становится флуоресцентным посредством реакции щелчка-химии и обнаруживается в формате многоязычной пластины. Этот способ применим к другим ацилтрансферазам, в которых используются субстраты, содержащие жирные кислоты, включая фосфолипиды и ацил-КоА.
Introduction
Бактериальные липопротеины характеризуются ковалентно связанными жирными кислотами на их амино-концах, через которые они закрепляются в мембранах 1,2. Зрелая часть белка очень разнообразна по структуре и функции, тем самым объясняя роль липопротеинов в различных биологических процессах в оболочке бактериальной клетки.
Липопротеины модифицируются жирными кислотами, полученными из фосфолипидов, после введения в цитоплазматическую мембрану. Пролипопротеины содержат фирменный мотив, липобокс, который содержит инвариантный остаток цистеина, который становится ацилированным и первой аминокислотой в зрелом белке. Первая стадия этого пути катализируется пролипопротеином фосфатидилглицерином: :d яцилглицерилтрансферазой (Lgt), которая переносит диацилглицерильную группу из фосфатидилглицерина в пролипопротеин через тиоэтерную связь между диацилглицерилом и цистеином. Сигнальная пептидаза II (Lsp) расщепляет сигнальный пептид от диацилглицерильного пролипопротеина, в результате чего образуется аполипопротеин, который закрепляется в мембране через его диацилглицерильный фрагмент. Третья и последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt), которая добавляет жирную кислоту из положения sn-1 фосфолипида на аполипопротеин, в результате чего образуется триацилированный зрелый липопротеин (рисунок 1)3. Реакция Lnt представляет собой двухступенчатую реакцию пинг-понга, в которой образуется стабильный промежуточный продукт тиоэфирного ацилового фермента. Побочный продукт лизофосфолипида высвобождается до ацилирования аполипопротеинового субстрата на второй стадии реакции.
Специфичность фосфолипидного субстрата определяется в анализе Lnt на основе сдвига подвижности N-ацилдиацилглицерилового пептида на высоком процентном содержании Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Фосфолипиды с небольшими полярными головными группами, насыщенными [sn-1] и ненасыщенными [sn-2], были предпочтительными субстратами4. Анализ сдвига геля не подходит для обширных кинетических исследований аполипопротеина N-ацилтрансферазы или для HTS для идентификации ингибирующих молекул. Click-химия с использованием алкиновых жирных кислот была успешно использована для изучения модификации липопротеинов у бактерий5 и метаболизма жирных кислот у эукариот6. Недавно сообщалось, что анализ пальмитоилирования Ras пальмитоилирования in vitro выявил ингибиторы7.
В способе, описанном здесь, очищенный активный Lnt в моющем средстве инкубируют с субстратами в смешанных мицеллах с образованием алкин-триацилированного пептида, который впоследствии обнаруживается флуоресцентной спектрометрией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ферментная и субстратная подготовка
- Очистка фермента
- Производят и очищают фермент Lnt от моющих солюбилизированных мембран, как описано ранее 4,8. Вкратце, индуцируют экспрессию гена lnt-стрептокка, кодирующего Lnt с помощью С-концевой стрептококковой метки, при OD600 0,6 безводным тетрациклином (200 нг/мл) при 37 °C в течение 16 ч.
- Собирайте клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 10 мин и выбрасывайте супернатант.
- Повторное суспендирование ячейки гранулы в буфере WA (20 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА) до 100OD 600 единиц на мл.
- Разбейте ячейки двумя проходами через французский пресс нажимной ячейки при 10 000 фунтов на квадратный дюйм.
- Удалите неповрежденные клетки и мусор центрифугированием при 13 000 х г в течение 20 мин. Сохраните супернатант и выбросьте гранулу.
- Центрифугируют супернатант при 120 000 х г в течение 60 мин и собирают мембранные везикулы (полупрозрачные гранулы коричневого цвета). Выбросьте супернатант.
- Солюбилизируют интегральные мембранные белки из мембранной гранулы с 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозидом (ДДМ) в буфере WA в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга и удаление нерастворимого материала при 120 000 х г в течение 30 мин. Используйте надводную фракцию для очистки.
- Очистите Lnt-стрептококк на колонке аффинной хроматографии (см. Таблицу материалов) и колонне фильтрации геля S400 (см. Таблицу материалов), как описано Nozeret et al.8.
- Хранят очищенный фермент в буфере WA, содержащем 0,05% DDM и 10% глицерина при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент стабилен более 5 лет.
- Получение алкин-фосфолипидных и биотинилированных субстратов фибробласт-стимулирующего лиганда (FSL-1-биотина)
- Аликвота 100 мкл специально синтезированного алкина-ПАПЫ (1-гексадек-15-иноил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, см. Таблицу материалов) солюбилизируется в хлороформе в пробирки по 1,5 мл.
- Проткните трубки шприцем и испарите хлороформ в скоростном вакууме при РТ в течение 2 ч. Хранить сухие образцы фосфолипидов при температуре -20 °C.
- Растворяют алкин-ПОУП в 0,1% Тритоне Х-100 при 500 мкМ перед применением. Добавьте 3-минутный этап обработки ультразвуком на водяной бане в RT для солюбилизации алкина-POPE при необходимости.
- Повторное суспендирование FSL-1-биотина в воде при 445 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба раствора можно хранить при температуре -20 °C в течение не менее 2 месяцев.
2. Трубчатый анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день устанавливают реакцию Lnt в пробирках объемом 1,5 мл (стадия 2.1) и покрывают 96 пластин скважин стрептавидином (стадия 2.2).
- Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
- Для стандартного анализа Lnt смешайте алкин-POPE (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 445 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) при конечном объеме 18 мкл в пробирках 1,5 мл. Выполняйте все условия в трех экземплярах.
- Соникировать субстратную смесь (приготовленную на стадии 2.1.1) в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане и инкубировать при 37°С в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 2.1.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: MTSES (натрий (2-сульфонатоэтил)метанетиосульфонат), тиол-специфический реагент, ингибирует Lnt8. Добавьте 10 мМТЭС (100 мМ запасного раствора в 100% ДМСО) в реакционные трубки (этап 2.1.1), которые будут использоваться в качестве отрицательных контрольных образцов. Отрегулируйте объем реакционного буфера Lnt таким образом, чтобы общий объем составлял 18 мкл. - Добавляют активный (1 нг/мкл, соответствующий 17,2 нМ) или неактивный Lnt (C387S) (2 мкл 10 нг/мкл запаса в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) и смешивают с подложками (стадия 2.1.2) путем пипетки вверх и вниз.
- Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
- Стрептавидиновое покрытие 96 плит скважин
- Готовят стоковый раствор стрептавидина по 2 мг/мл вH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при -20 °C до 6 месяцев. - Из исходного раствора готовят 10 мкг/мл стрептавидина в воде в качестве рабочего раствора. Добавьте 100 мкл раствора в каждую лунку 96-луночной пластины. Связывают стрептавидин с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.
- Готовят стоковый раствор стрептавидина по 2 мг/мл вH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 2.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 2.4), а также обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 2.5).
- Щелк-химическая реакция
- Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (5 мМ в ДМСО), TCEP (Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 50 мМ, приготовленный в воде), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 2 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO4∙5H2O(50 мМ свежеприготовленный вH2O).
- В пробирках объемом 1,5 мл, содержащих реакционную смесь Lnt, приготовленную на стадии 2.1.4, выполняют щелк-химию путем добавления реагентов в следующем порядке: 0,2 мкл запаса Азидо-ФАМ (конечная концентрация 50 мкМ), 0,4 мкл запаса TCEP (конечная концентрация 1 мМ), 0,2 мкл запаса TBTA (конечная концентрация 0,02 мМ).
- Вихрь раствора в течение 5 с. Затем добавляют 0,4 мкл запаса CuSO4 (конечная концентрация 1 мМ). Вихрь снова в течение 5 с. Инкубируют образцы в темноте при RT в течение 1 ч.
- Связывание реакционной смеси Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином
- Промывайте лунки пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 2.2.2 3x с 200 мкл PBS-T1 (PBS, содержащий 0,05% Tween-20).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины стрептавидина можно использовать немедленно или хранить в сухом виде при температуре 4 °C. - Перенесите 18 мкл из щелково-химической смеси со стадии 2.3.3 в скважину в пластине, покрытой стрептавидином, из 96 скважин и добавьте 100 мкл PBS-T1 для связывания N-ацил-FSL-1-биотина-FAM продукта со стрептавидиновыми пластинами.
- Используйте биотин-флуоресцеин (0,26 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и считывания флуоресценции.
- Инкубировать пластины на RT в течение 1 ч в темноте в термомиксаторе, встряхивая при 300 об/мин.
- Выполните этапы ручной мойки 96 плит скважины с помощью многоканальной электронной пипетки следующим образом: шесть промывок с 200 мкл PBS-T2 (PBS, содержащий 1% Tween-20), три промывки пипеткой, три промывки с 200 мкл PBS, три промывки с пипеткой.
- Промывайте лунки пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 2.2.2 3x с 200 мкл PBS-T1 (PBS, содержащий 0,05% Tween-20).
- Обнаружение и анализ флуоресценции
- Добавьте 200 мкл PBS и запишите флуоресценцию при 520 нм в считывателе флуоресцентных микропластин. Сохраняйте результаты в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-флуоресцеин используется в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и обнаружения флуоресценции при 520 нм. Ожидается воспроизводимое считывание 30 000–40 000 а.е. с 0,26 мкМ биотин-флуоресцеина. Все образцы анализируются в трех экземплярах, включая контрольные. - Рассчитайте стандартное отклонение для каждой реакции и рассчитайте P-значения для отрицательных контрольных и положительных образцов с помощью непарного t-теста с использованием статистического программного обеспечения.
- Добавьте 200 мкл PBS и запишите флуоресценцию при 520 нм в считывателе флуоресцентных микропластин. Сохраняйте результаты в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
3. Многоязычный пластинчатый анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день наладили реакцию Lnt в 384 плитах скважины (стадия 3.1) и покрыли 384 пластины скважин стрептавидином (этап 3.2).
- Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество реагентов и фермента уменьшается по сравнению с трубчатым анализом, и реакция Lnt выполняется непосредственно в 384 пластинах скважины. Это позволяет использовать меньше материала и сократить шаги, которые могут быть дополнительно автоматизированы.- Смешайте субстраты следующим образом: алкин-ПОУП (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) в объеме 13,5 мкл на реакцию на скважину в формате пластины 384 лунки. Выполняйте все условия в трех экземплярах. Рассчитать общее количество реагентов, необходимых для количества реакций, которые должны быть выполнены (т.е. 5 184 мкл на одну пластину скважины 384).
- Наносите ультразвуком субстратную смесь в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане.
- Аликвота 13,5 мкл субстратной смеси на скважину в плите 384 скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля на скважину можно добавить 10 мМТЭС (625 мМ запасного раствора в 100% ДМСО). Отрегулируйте объем буфера Lnt (шаг 3.1.1) для достижения конечного реакционного объема 13,5 мкл. - Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 3.1.5).
- Добавьте 0,5 нг/мкл (что соответствует 8,6 нМ) активного фермента Lnt или неактивный вариант (C387S) (1,5 мкл из запаса 5 нг/мкл в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) в буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) к каждой скважине, содержащей реакционную смесь со стадии 3,1.3. Смешайте реагенты путем пипетки вверх и вниз. Общий реакционный объем составляет 15 мкл.
- Запечатайте пластину пластиковой фольгой для многоскважинных пластин.
- Инкубировать при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
- Стрептавидиновое покрытие 384 плиты скважины
- Используйте 75 мкл стрептавидина (10 мкг/мл вH2O) со стадии 2.2.2 для покрытия скважин из 384 скважинной пластины. Пусть стрептавидин связывается с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 3.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 3.4), обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 3.5).
- Щелк-химическая реакция
- Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (1,2 мМ в ДМСО), TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 24 мМ, приготовленные вH2O), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 0,48 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO4∙5H2O(24 мМ, свежеприготовленные вH2O).
- Смешайте три химических реагента: смесь Azido-FAM (конечная концентрация 50 мкМ), TCEP (конечная 1 мМ) и TBTA (конечная 0,02 мМ), каждая по 0,75 мкл в конечном объеме 2,25 мкл на лунку. Рассчитать необходимый объем на 384 плиты скважины (т.е. использовать 864 мкл при использовании всех скважин 384 плиты скважины). Энергично перемешать.
- Добавляют 2,25 мкл раствора реагента на скважину непосредственно к завершенной реакции Lnt в пластине 384 скважины со стадии 3.1.7.
- Смешивание путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
- Добавьте CuSO4 (0,75 мкл из запаса 24 мМ для конечной концентрации 1 мМ) и перемешайте путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
- Инкубировать на RT в течение 1 ч в темноте.
- Связывание реакционной смеси Lnt с 384 пластинами скважины со стрептавидиновым покрытием
- Промывайте колодцы пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 3.2.1 1x с 85 мкл PBS-T1.
- Перенесите 11 мкл реакции щелкающей химии из каждой лунки инкубационной пластины со стадии 3.3.6 на пластину, покрытую стрептавидином, со стадии 3.4.1 для связывания продукта N-ацил-FSL-1-биотин-FAM с пластинами стрептавидина.
- Добавьте 64 мкл буфера PBS-T1.
- Включить биотин-флуоресцеин (0,19 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве контроля для связывания с скважинами, покрытыми стрептавидином.
- Инкубировать 384 пластины скважины на RT в течение 1 ч в темноте в термомикшере, встряхивая при 300 об/мин.
- Мойте пластины с помощью автоматизированной посудомоечной машины следующим образом: 10 стирок с 85 мкл PBS-T2, пластины встряхивают между промывками; 5 стирок с 85 мкл PBS, пластины встряхивают между стирками.
- Обнаружение и анализ флуоресценции
- Добавьте PBS (85 мкл) и запишите флуоресценцию в считывателе флуоресцентных микропластин при 535 нм.
- Анализируйте данные, как описано (шаг 2.5.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В реакции Lnt жирная кислота sn-1 из фосфолипидов переносится на диацилглицерилпептид, в результате чего образуется зрелый триацилированный пептид8. Анализ in vitro Lnt, описанный здесь, предназначен для использования фосфолипидов, содержащих алкиновую жирную кислоту (alkyne-POPE) и FSL-1-биотин в качестве субстратов, что приводит к образованию алкина-FSL-1-биотина. При щелковой химической реакции с азидо-ФАМ этот продукт должен быть флуоресцентно меченым и обнаруживаться флуоресцентной спектрометрией (рисунок 2).
Условия реакции были оптимизированы для максимального считывания флуоресценции при 520 нм в пластинчатом считывателе. При ферменте 1 нг/мкл наблюдалось полное превращение FSL-1-биотина8 (рисунок 3). Отрицательный контроль включал реакции без фермента, с неактивным вариантом фермента (мутант активного центра C387S) или с тиол-специфическим ингибитором MTSES, которые приводят к обнаружению низкой флуоресценции. Биотин-флуоресцеин эффективно связывался с пластинами, покрытыми стрептавидином, и использовался в качестве внутреннего контроля для максимального флуоресцентного сигнала. Все эксперименты проводились в расчетах тройного и стандартного отклонения, а статистический анализ показал, что анализ был чувствительным и воспроизводимым.
Для того, чтобы разработать анализ HTS для скрининга ингибиторов малых молекул Lnt, количество реагентов было уменьшено, и реакции проводились непосредственно в 384 пластинах скважины. Кроме того, этапы промывки были автоматизированы с помощью пластинчатой шайбы (см. Таблицу материалов). Что касается трубчатого анализа, то реакция была чувствительной и воспроизводимой, со значительной разницей между отрицательным контролем (C387S) и активным ферментом (Lnt) (рисунок 4). В HTS коэффициент Z' определяет, является ли ответ в анализе достаточно большим для целей скрининга9 , и рассчитывается с использованием следующего уравнения:
Где S — средний сигнал, B — фоновый сигнал, а σ — стандартное отклонение.
Средний Z-фактор составил >0,6 для анализа Lnt, выполненного в формате HTS с использованием 384 пластин скважины, что позволяет предположить, что анализ для скрининга малых молекул на ингибирование Lnt был выдающимся.
Рисунок 1: Ферментативные реакции в посттрансляционной модификации липопротеинов в протеобактериях. Последовательные шаги катализировались Lgt10, Lsp11 и Lnt 12,13,14 в цитоплазматической мембране. PGN: пептидогликан, SP: сигнальный пептид, LB: липобокс, консервированный мотив, содержащий Cys+1 и модифицированный жирными кислотами и первой аминокислотой в зрелом липопротеине, PG: фосфатидилглицерин, G-1-P: глицерин-1-фосфат, PE: фосфатидилэтаноламин, лизоPE: лизо-фосфатидилэтаноламин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема фторометрического ферментного анализа аполипопротеина N-ацилтрансферазы (Lnt). Субстраты FSL-1-биотин (желтый) и алкин-ПАПА (синий) смешивали с очищенным ферментом Lnt, солюбилизированным в моющем средстве. Реакцию проводили в смешанных мицеллах при 37 °C (стадия 1). Алкин-FSL-1-биотиновый продукт маркировали флуоресцеином (оранжевым) путем щелчка химии (этап 2) и обнаруживали в считывателе флуоресцентных пластин при связывании с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 3). Рисунок является модифицированной версией рисунка 1B , опубликованной Nozeret et al.8 в соответствии с лицензией Creative Commons (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Флуоресцентное обнаружение активности Lnt в формате 96 скважин. Lnt-реакции проводили в пробирках при 37 °C в течение 16 ч. После флуоресцентной маркировки с помощью щелчковой химии и связывания с пластинами, покрытыми стрептавидином, флуоресценцию измеряли с помощью флуоресцентной спектрометрии. Биотин-флуоресцеин (биотин-флуо 0,26 мкМ) использовался в качестве контроля для флуоресценции. Буфер был только реакционным буфером. Образцы, указывающие на алкин-POPE (50 мкМ), FSL-1-биотин (50 мкМ) и субстраты (смесь алкина-POPE и FSL-1-биотина, по 50 мкМ каждый) не содержали фермента. Отрицательный контроль включал ингибирование с помощью MTSES (10 мМ) и неактивный вариант Lnt (C387S). Фермент Lnt добавляли при 1 нг/мкл. Стандартные отклонения были рассчитаны для n = 3 экспериментов. ** P-значение < 0,005. Возбуждение при 494 нм, полоса пропускания 5 нм и излучение при 520 нм, полоса пропускания 5 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Флуоресцентное считывание реакции Lnt в пластине 384 скважины, совместимой с HTS. Ферментативные Lnt-реакции проводили в 384 пластинах скважин при 37 °C. Биотин-флуоресцеин (биотин-флуо 0,19 мкМ) использовался в качестве контроля для флуоресценции. Буфер представлял собой реакционный буфер, содержащий ДМСО. Отрицательный контроль включал ингибирование с помощью MTSES (10 мМ) и неактивный вариант Lnt (C387S). Фермент Lnt добавляли при 0,5 нг/мкл. Стандартные отклонения были рассчитаны для n = 3 экспериментов. P-значение < 0,0005. Возбуждение при 485 нм, полоса пропускания 20 нм и излучение при 535 нм, полоса пропускания 25 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол для анализа Lnt, описанный здесь, основанный на флуоресцентном обнаружении триацилированного продукта, является чувствительным и воспроизводимым. Специфическое и эффективное связывание биотина со стрептавидином является ключевым элементом анализа. Субстрат Alkyne-POPE, оставшийся после завершения реакции Lnt, также флуоресцентно маркируется FAM, но эффективно удаляется после связывания на пластинах стрептавидина несколькими шагами промывки. Кроме того, добавление DMSO не влияет на активность Lnt и не влияет на анализ. Как субстрат, так и фермент являются высоколипофильными и требуют условий реакции в смешанных мицеллах. Методы, которые зависят от растворимых ферментов и субстратов для обнаружения продукта, включая флуоресцентную поляризацию, неприменимы8. Единственным ограничением анализа является совместимость фермента с алкинным субстратом, поскольку реакция клик-химии зависит от этой химической группы.
В предыдущих исследованиях сообщалось о анализах сдвига геля для анализа активности Lnt и определения специфичности субстрата4. С текущим протоколом и параллельно с флуоресцентной спектрометрией внутригелевая флуоресцентная детекция может быть использована для мониторинга активности Lnt8, хотя этот формат не подходит для HTS. Трубчатый анализ особенно интересен для кинетических и сравнительных исследований Lnt-мутантов. Специфичность фосфолипидного субстрата может быть решена с помощью алкин-фосфолипидов, полученных метаболической маркировкой бактерий алкиновыми жирными кислотами, состоящими из различных длин цепей и степени насыщения, как описано8.
Формат пластины 384 лунки совместим с исследованиями HTS, поскольку наблюдается значительная разница между активным ферментом и контролем только субстрата. Средний Z-коэффициент >0,6 был рассчитан с оптимизированными условиями, представленными здесь. Высокая воспроизводимость анализа способствует высокому Z'-фактору. Для успешного HTS рекомендуется Z-коэффициент выше 0,69. Этапы мойки эффективны благодаря использованию автоматизированной посудомоечной машины. Другие этапы могут быть дополнительно оптимизированы, включая пипетирование реагентов, что позволит экранировать большие библиотеки малых молекул.
Протокол применим к другим ацилтрансферазам, использующим субстраты, содержащие жирные кислоты, если алкинные группы совместимы с распознаванием субстрата ферментом. Недавнее исследование по идентификации специфических ингибиторов эукариотической пальмитоилацилтрансферазы (PAT) описывает использование мембраносвязанного фермента и алкина-ацил-КоА в качестве субстрата7. Пальмитоилирование небольшого биотинилированного пептида Ras наблюдалось путем флюорогенного обнаружения щелк-химии. Пилотный экран в формате 384 лунок этого анализа идентифицировал специфические ингибиторы ПАТ, предполагая, что субстраты, состоящие из группы алкиновых жирных кислот в сочетании с щелкнутой химией и чувствительным флуоресцентным обнаружением, являются перспективным методом для HTS на основе мишеней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Фабриса Агу и Аликс Бушарла из Платформы химиогеномного и биологического скрининга, Центра технологических ресурсов и исследований (C2RT) в Институте Пастера в Париже за полезные предложения по протоколу, всех членов подразделения BGPB за поддержку и научные обсуждения и Саймона Легуда за критическое прочтение рукописи. Работа финансировалась Глобальными инициативами по уходу Института инфекционных заболеваний Карно и Института микробов и здоровья Карно (15 CARN 0017-01 и 16 CARN 0023-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
