Summary

Обычные BODIPY конъюгирует для микроскопии с суперразрешением Live-Cell и одномолекулярного слежения

Published: June 08, 2020
doi:

Summary

Обычные конъюги BODIPY могут быть использованы для живой-клеточной одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM) путем эксплуатации их преходящее, красно-сдвигаемых стриеров земли. Мы представляем оптимизированный протокол SMLM для отслеживания и разрешения субклеточных нейтральных липидов и жирных кислот в живых клетках млекопитающих и дрожжей в наноскопической шкале длины.

Abstract

Методы локализации одной молекулы (SMLM) преодолевают оптический предел дифракции обычной флуоресценционной микроскопии и могут разрешать внутриклеточные структуры и динамику биомолекул с точностью 20 нм. Предпосылкой для SMLM являются флюорофоры, которые переходят из темного в флуоресцентное состояние, чтобы избежать пространственно-временного перекрытия их функций точечного распространения в каждом из тысяч кадров для сбора данных. BODIPYs являются устоявшимися красителями с многочисленными конъюгами, используемыми в обычной микроскопии. Переходное образование красно-сдвигающихся димеров НАИППи (DII)приводит к яркому выбросу одной молекулы, позволяющему микроскопию локализации одной молекулы (SMLM). Здесь мы представляем простой, но универсальный протокол для SMLM с обычными спариями BODIPY в живых дрожжах и клетках млекопитающих. Эта процедура может быть использована для получения изображений супер-разрешения и для отслеживания одного состояния BODIPY-DII для извлечения пространственно-временной информации конъюгированных BODIPY. Мы применяем эту процедуру для разрешения липидных капель (ЛД), жирных кислот и лисосомы в живых дрожжах и клетках млекопитающих в наноскопической шкале длины. Кроме того, мы демонстрируем возможность многоцветной визуализации с красителями BODIPY при использовании в сочетании с другими флуоресцентными зондами. Наши репрезентативные результаты показывают дифференциальное пространственное распределение и подвижность БОДИПИ-жирных кислот и нейтральных липидов в дрожжах в условиях кормления и поста. Этот оптимизированный протокол для SMLM может быть использован с сотнями коммерчески доступных конъюгатов BODIPY и является полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне, далеко за пределами применения этой работы.

Introduction

Одномолекулярная локализация микроскопии (SMLM) методы, такие как стохастической оптической реконструкции микроскопии (STORM) и фото-активированной локализации микроскопии (PALM) появились как методы для генерации супер-разрешение изображения с информацией за пределами оптического дифракции Абба предел1,2 и для отслеживания динамики отдельных биомолекул3,4. Одним из требований к зондам, совместимым с SMLM, является возможность контролировать количество активных фторфоров в любое время, чтобы избежать пространственного перекрытия их функций точечного распространения (PSF). В каждом из тысяч кадров для сбора данных местоположение каждого флуоресцентного флуорофора определяется с точностью 20 нм, устанавливая соответствующую функцию точечного распространения. Традиционно, выключенное мигание фторофоров было контролироваться через стохастические фотопереключения1,,2,,5 или химически индуцированного внутреннего мигает6. Другие подходы включают индуцированной активации флюорогенов при переходных связывания с флюорогеновым активированием белка7,,8 и программируемой связывания-несвязывающей помеченных олигомеров ДНК в общей внутренней флуоресценции отражения (TIRF) или возбуждения светового листа9. Недавно мы сообщили о новой и универсальной стратегии маркировки для SMLM10, в которой ранее сообщалось красно-сдвиной димерической (DII) состояния обычных бор ди-пирометан (BODIPY) конъюгирует11,12,13являются специально возбужденных и обнаружены с красными сдвинутых волн.13

BODIPYs широко используются красители с сотнями вариантов, которые специально этикетки субклеточных отсеков и биомолекул14,15,16. Из-за их простоты использования и применимости в живых клетках, варианты BODIPY коммерчески доступны для обычной флуоресценции микроскопии. Здесь мы описываем подробный и оптимизированный протокол о том, как сотни коммерчески доступных конъюгатов BODIPY могут быть использованы для живых ячеек SMLM. Путем настройки концентрации мономеров BODIPY и оптимизации лазерных функций возбуждения, параметров визуализации и анализа данных, в живых клетках получаются высококачественные изображения суперразрешения и данные слежения за одной молекулой. При использовании при низкой концентрации (25-100 нм), конъюгированные bodiPY могут быть одновременно использованы для SMLM в красно-сдвигаемканале и для корреляционной обычной флуоресценции микроскопии в обычном канале выбросов. Полученные данные одной молекулы могут быть проанализированы для количественной оценки пространственной организации неподвижных структур и извлечения диффузивных состояний молекул в живых клетках17. Наличие зондов BODIPY в зеленых и красных формах позволяет использовать многоцветные изображения при правильном сочетании с другими совместимыми флюорофорами.

В этом отчете мы предоставляем оптимизированный протокол для получения и анализа данных SMLM с живыми ячейками с использованием BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 красного и lysotracker-зеленого цвета в нескольких цветах. Мы разрешаем жирные кислоты и нейтральные липиды в живых дрожжах и клетках млекопитающих с разрешением 30 нм. Мы также демонстрируем, что дрожжевые клетки регулируют пространственное распределение внешних жирных кислот в зависимости от их метаболического состояния. Мы находим, что добавленные БОДИПИ-жирные кислоты (FA) локализуются в эндоплазмический ретикулум (ER) и липидные капли (ЛД) в условиях fed, в то время как BODIPY-FAs образуют не-LD кластеры в плазменной мембране после поста. Мы также расширяем применение этого метода для изображения лизосомы и LDs в живых клетках млекопитающих. Наш оптимизированный протокол для SMLM с использованием обычных конъюгетов BODIPY может быть полезным ресурсом для изучения биологических процессов на наноуровне с множеством доступных конъюги BODIPY.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Для клонирования дрожжей и эндогенных пометок пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации10. 1. Подготовка образцов дрожжевых клеток для визуализации Подготовьте жидкую ночную культуру штамма дрожжей w303. Используя стерильную деревя?…

Representative Results

Здесь мы представляем оптимизированную подготовку образца, процедуру сбора и анализа данных для SMLM с использованием конъюги для BODIPY на основе вышеуказанного протокола(рисунок 1A). Чтобы продемонстрировать пример рабочего процесса для получения и анализа данных SMLM, мы и…

Discussion

В этом протоколе мы продемонстрировали, как обычные конъюгированные BODIPY могут быть использованы для получения изображений SMLM с улучшением пространственного разрешения на порядок. Этот метод основан на использовании ранее сообщалось, красно-сдвинутые DII состояния обычных краси?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование, о проислизировавее в этой публикации, было поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии R21GM127965.

Materials

BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

Riferimenti

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

View Video