קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה
Summary
שערי מעלה קונבנציונאלי BODIPY ניתן להשתמש עבור מיקרוסקופ לוקליזציה של תא לחיות בודד (SMLM) באמצעות ניצול של היווצרות הארעיות שלהם, אדום העביר המדינה הקרקע. אנו מציגים פרוטוקול SMLM אופטימיזציה כדי לעקוב ולפתור ליפידים ניטרליים שומנים וחומצות שומן בתאי היונקים החיים בקנה מידה nanoscopic באורך.
Abstract
מיקרוסקופ יחיד לוקליזציה של מולקולות (SMLM) טכניקות להתגבר על מגבלת עקיפה אופטית של מיקרוסקופ הזריחה המקובלת והוא יכול לפתור מבנים תאיים ואת הדינמיקה של biomolecules עם ~ 20 דיוק ננומטר. תנאי מוקדם עבור SMLM הם fluorophores כי מעבר מחושך למצב פלורסנט כדי למנוע חפיפה בזמן הזמני של פונקציות התפשטות הנקודה שלהם בכל אחד מאלפי מסגרות רכישת נתונים. BODIPYs הם צבעים מבוססים היטב עם שערים רבים המשמשים במיקרוסקופיה קונבנציונאלי. היווצרות ארעי של אדום העביר BODIPY הקרקע מדינה דימרס (DII) תוצאות פליטת מולקולה אחת בהירה המאפשר מיקרוסקופ יחיד לוקליזציה מיקרוסקופית (smlm). כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט אבל תכליתי עבור SMLM עם שערי מעלה קונבנציונאלי BODIPY בתוך שמרים חיים ותאי יונקים. הליך זה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה סופר ולעקוב אחר BODIPY-DII מדינות כדי לחלץ מידע הזמני של העיר bodipy מעלה. אנו להחיל את ההליך הזה כדי לפתור טיפות שומנים (המוני), חומצות שומן, ו-lysosomes החיים שמרים ותאי מיונקים בסולם אורך nanoscopic. יתר על כן, אנו מדגימים את יכולת הדמיה רב צבעי עם צבעים BODIPY כאשר נעשה שימוש בשילוב עם בבדיקות פלורסנט אחרים. תוצאות הנציג שלנו להראות את ההפצה המרחבית מרחבית וניידות של חומצות BODIPY שומן ושומנים ניטרליים בשמרים מתחת לתנאים ומוזנים. פרוטוקול ממוטב זה עבור SMLM ניתן להשתמש עם מאות שערים BODIPY זמין מסחרית והוא משאב שימושי כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים בקנה המידה הרבה מעבר ליישומים של עבודה זו.
Introduction
מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת (smlm) טכניקות כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה) ומיקרוסקופ צילום מופעל-תמונה (PALM) התפתחה כשיטות ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה עם מידע מעבר למגבלת העקיפה האופטית של אבה1,2 ועבור מעקב אחר הדינמיקה של יחיד biomolecules3,4. אחת הדרישות עבור הבדיקות תואם SMLM היא היכולת לשלוט על מספר fluorophores פעיל בכל עת כדי למנוע חפיפה מרחבית של פונקציות התפשטות הנקודה שלהם (PSF). בכל אחד מאלפי מסגרות רכישת נתונים, המיקום של כל fluorophores פלורסנט נקבע אז עם ~ 20 הדיוק ננומטר על ידי התאמת הפונקציה המקבילה שלה התפשטות נקודה. באופן מסורתי, מהבהב על-off של fluorophores נשלטת באמצעות מיתוג סטוכסטי החלפת1,2,5 או כימית המושרה מהבהב6. גישות אחרות כוללות את ההפעלה המושרה של fluorogens על כריכה ארעית לחלבון fluorogen מפעיל7,8 ואת הכריכה ניתנת לתיכנות-unbinding של התוויות DNA oligomers בתוך השתקפות פנימית הכולל השתקפויות (tirf) או האור בגיליון עירור9. לאחרונה, דיווחו על אסטרטגיה הרומן תיוג רב-תכליתי עבור smlm10 שבו דיווחו בעבר אדום העביר dimeric (DII) מדינות של בורון קונבנציונאלי di-pyromethane (bodipy) מעלה מעלה11,12,13 הם באופן היווצרות ולהיות נרגש במיוחד מזוהה עם אדום העביר אורכי גל.
Bodipys הם בשימוש נרחב צבעים עם מאות משתנים כי במיוחד תווית sub-סלולריים תאים ו biomolecules14,15,16. בשל קלות השימוש שלהם והישימות בתאי החיים, משתני BODIPY הם מסחרית זמין עבור מיקרוסקופ זריחה קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט וממוטב על איך מאות שערי הבודיפיה הזמינים מסחרית ניתן להשתמש עבור התאים החיים-SMLM. על ידי כוונון הריכוז של bodipy ונומרים ועל ידי אופטימיזציה של כוחות לייזר עירור, הדמיה וניתוח נתונים פרמטרים, איכות גבוהה סופר ברזולוציה תמונות מולקולה יחידה מעקב נתונים מושגת בתאי החיים. כאשר נעשה שימוש בריכוז נמוך (25-100 nM), שערי הבודיפיה יכולים לשמש בו ל-SMLM בערוץ האדום-הוזז ולצורך הקורסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הקונבנציונאלית בערוץ הפליטה המקובל. ניתן לנתח את נתוני המולקולה היחידה לכמת את הארגון המרחבי של מבנים מוכי תנועה ולחלץ את המצבים המפזרים של מולקולות בתאי החיים17. הזמינות של בדיקה BODIPY הן ירוק והן צורות אדומות מאפשר הדמיה מרובת צבעים כאשר נעשה שימוש בשילוב הנכון עם fluorophores תואמים אחרים.
בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב לרכישת וניתוח של נתוני SMLM החיים באמצעות BODIPY-C12, bodipy (493/503), Bodipy-c12 אדום ו lysotracker-ירוק בצבעים מרובים. אנו פותרים חומצות שומן ושומנים ניטרליים בתוך שמרים ותאי יונקים חיים עם ~ 30 החלטה ננומטר. אנו עוד להדגים כי תאים שמרים לווסת את התפלגות מרחבית של חומצות שומן חיצוני מוסף בהתאם למצב חילוף החומרים שלהם. אנו מוצאים כי הוסיף חומצות שומן BODIPY (הפא) הוקליזציה לרשת האנדופלזמית (ER) ו טיפות השומנים (המזיהוי) תחת תנאי ההזנה ואילו האשכולות BODIPY-בצורה לא LD בקרום פלזמה על צום. אנו מרחיבים עוד יותר את היישום של טכניקה זו לליזומים ולתעודות זהות בתאי יונקים חיים. הפרוטוקול הממוטב שלנו ל-SMLM באמצעות שערי מעלה קונבנציונאלי בBODIPY יכול להיות משאב שימושי כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים בסולם הננו עם מספר רב של בעלי הבניינים הזמינים BODIPY.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הדגמנו כיצד שערי מצוכי קונבנציונאלי BODIPY ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות SMLM עם סדר גודל שיפור בהיקף ברזולוציה מרחבית. שיטה זו מבוססת על ניצול שדווחו בעבר, אדום העבירמצבים של צבע BODIPY קונבנציונאלי, אשר בצורה מעוברת דרך מפגשים דו-מולקולריים. מצבים אלה יכולים להיות נרגשים במיו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Riferimenti
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
