Vi beskriver en metod för att identifiera neutrophil extracellulära fällor (ELT) i formaldehyde-fasta och paraffin-inbäddade feline cardiogenic kranskärlens trombi med värme-inducerad antigen hämtning och en dubbel immunmärkning protokoll.
Neutrophil extracellulära fällor (NET), bestående av cellfria DNA (cfDNA) och proteiner som histoner och neutrofil elastase (NE), frigörs av neutrofiler som svar på systemisk inflammation eller patogener. Även om unga som varken arbetar eller studerar har visat sig öka bildningen av blodproppar och hämma fibrinolys hos människor och hundar, har net-värdets roll hos katter med kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), en livshotande komplikation sekundärt till hypertrofisk kardiomyopati , är okänd. En standardiserad metod för att identifiera och kvantifiera unga och unga i kardiogen arteriell trombi hos katter kommer att öka vår förståelse av deras patologiska roll i CATE. Här beskriver vi en teknik för att identifiera UNGATs i formaldehyd-fasta och paraffin-inbäddade trombi inom kolorektal bifurkation, extraheras under obduktion. Efter deparaffinering med xylen genomgick kolorektal sektioner indirekt värme-inducerad antigen hämtning. Avsnitt blockerades sedan, permeabilized och ex vivo EL IDENTIFIERADEs genom colocalization av cell-fria DNA (cfDNA), citrullinerade histon H3 (citH3) och neutrophil elastase (NE) med hjälp av immunofluorescence mikroskopi. För att optimera immunodetection av NETs i trombi, autofluorescens av vävnadselement begränsades med hjälp av en autofluorescens släckning process före mikroskopi. Denna teknik kan vara ett användbart verktyg för att studera unga och grundläggande teknik hos andra arter och ger nya insikter i patofysiologin i detta komplexa tillstånd.
Katter med hypertrofisk kardiomyopati löper risk för livshotande tromboembolic komplikationer1,2. Trots den höga sjuklighet och dödlighet som är associerade med felin kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), är den underliggande patofysiologi av CATE hos katter dåligt förstås. Det finns också begränsade diagnostiska och terapeutiska verktyg för att behandla och identifiera katter som löper risk för detta förödande tillstånd3.
Förutom sin roll i medfödd immunitet, neutrofiler har visat sig spela en roll i trombos genom att släppa neutrofil extracellulära fällor (NET), som är webb-liknande nätverk av cell-fria DNA (cfDNA) täckt med histoner och granulat proteiner som neutrofil elastas (NE) och myeloperoxidase. Neutrofiler genomgår nets bildas som svar på systemisk inflammation, direkt möte med patogener och interaktion med aktiverade trombocyter4,,5,,6,7. Hos hundar har neutrofilt-härledda DNA visat sig hämma koaguleringslys, medan NET-proteiner påskyndar koaguleringsbildningen. Nets förmåga att fånga cirkulerande celler och koaguleringskomponenter är också nyckeln till deras trombogenic egenskaper8,,9,,10,,11,12.
Unga och unga är detekt genom colocalization av extracellulära neutrofila proteiner, histoner och cfDNA. På grund av detta är identifiering och kvantifiering av unga som varken arbetar eller studerar i fasta vävnader genom immunfluorescens av deparaffinerade vävnader överlägsen traditionell hematoxylin- och eosinfläck (H&E) med hjälp av ljus fältmikroskopi4,,5. Flera humanstudier med immunofluorescensmikroskopi identifierade ungasum som strukturella komponenter i kranskärlstrombi, cerebral stroketrombi, aterolombos och venös trombi13,14,15,16,17. Hittills har en standardiserad metod för att upptäcka och kvantifiera unga som varken arbetar eller studerar i felint trombi beskrivits. Eftersom identifiering av unga som varken arbetar eller studerar i felin cardiogenic arteriell trombi kan underlätta framtida translationell forskning i unga och medelstora företag, beskriver vi tekniker för NET identifiering och bedömning i paraffin-inbäddade arteriell trombi hos katter.
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera UNGATs i fasta feline cardiogenic kranskärlens trombi med hjälp av en dubbel immunmärkning protokoll och immunofluorescens mikroskopi. Även om endast cardiogenic kranskärlens trombi var färgade, i teorin detta protokoll kan användas för andra typer av trombi och i andra veterinärmedicinska arter. Identifiering av unga som varken arbetar eller studerar inom felint arteriell trombi tyder på att unga som varken arbetar eller studerar kan spela en roll i trombos hos k…
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes av medel från University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Författarna vill erkänna Dr Kevin Woolard för användning av fluorescens mikroskop.
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |