Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.
Abstract
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), bestehend aus zellfreier DNA (cfDNA) und Proteinen wie Histonen und neutrophiler Elastase (NE), werden von Neutrophilen als Reaktion auf systemische Entzündungen oder Krankheitserreger freigesetzt. Obwohl NETs bisher gezeigt haben, dass sie die Gerinnselbildung verstärken und die Fibrinolyse bei Menschen und Hunden hemmen, ist die Rolle von NETs bei Katzen mit kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE), einer lebensbedrohlichen Komplikation, die zur hypertrophen Kardiomyopathie sekundär ist. , ist unbekannt. Eine standardisierte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von NETs in kardiogenen arteriellen Thromben bei Katzen wird unser Verständnis ihrer pathologischen Rolle in CATE fördern. Hier beschreiben wir eine Technik zur Identifizierung von NETs in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten Thromben innerhalb der Aortenverzweigung, die während der Nekropsie extrahiert wird. Nach der Deparaffinierung mit Xylol wurden Aortenschnitte indirekt wärmeinduzierte Antigenabrufungen unterzogen. Abschnitte wurden dann blockiert, permeabilisiert, und ex vivo NETs wurden durch Kolokalisierung von zellfreier DNA (cfDNA), citrulliniertem Histon H3 (citH3) und neutrophiler Elastase (NE) mittels Immunfluoreszenzmikroskopie identifiziert. Um die Immundetektion von NETs in Thromben zu optimieren, wurde die Autofluoreszenz von Gewebeelementen durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenching-Verfahrens vor der Mikroskopie eingeschränkt. Diese Technik könnte ein nützliches Werkzeug sein, um NETs und Thrombose bei anderen Arten zu studieren und bietet neue Einblicke in die Pathophysiologie dieses komplexen Zustandes.
Introduction
Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie sind dem Risiko lebensbedrohlicher thromboembolischer Komplikationen1,2ausgesetzt. Trotz der hohen Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit fein kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE) ist die zugrunde liegende Pathophysiologie von CATE bei Katzen schlecht verstanden. Es gibt auch begrenzte diagnostische und therapeutische Instrumente zur Behandlung und Identifizierung von Katzen, die von diesem verheerenden Zustand bedroht sind3.
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der angeborenen Immunität haben Neutrophilen gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Thrombose spielen, indem sie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen, die webartige Netzwerke zellfreier DNA (cfDNA) sind, die mit Histonen und granulären Proteinen wie Neutrophilenase (NE) und Myeloperoxidase verkrustet sind. Neutrophile durchlaufen NETs Bildung als Reaktion auf systemische Entzündung, direkte Begegnung mit Krankheitserregern, und Interaktion mit aktivierten Blutplättchen4,5,6,7. Bei Hunden, neutrophil-abgeleitete DNA hat sich gezeigt, dass GerinnselLyse hemmen, während NET-Proteine die Gerinnselbildung beschleunigen. Die Fähigkeit von NETs, zirkulierende Zellen und Gerinnungskomponenten zu fangen, ist auch der Schlüssel zu ihren thrombogenen Eigenschaften8,9,10,11,12.
NETs werden durch Kolokalisierung von extrazellulären neutrophilen Proteinen, Histonen und cfDNA nachgewiesen. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Quantifizierung von NETs in festen Geweben durch Immunfluoreszenz von deparaffiniertem Gewebe dem traditionellen Hämatoxylin- und Eosinfleck (H&E) mit Hellfeldmikroskopie4,5überlegen. Mehrere Studien am Menschen mit Immunfluoreszenzmikroskopie identifizierten NETs als strukturelle Komponenten von koronaren arteriellen Thromben, zerebralen Schlaganfall-Thromben, Atherothrombose und venösem Thrombi13,14,15,16,17. Bis heute wurde eine standardisierte Methode zur Erkennung und Quantifizierung von NETs in Katzenthromben nicht beschrieben. Da die Identifizierung von NETs in transinenkardiinen arterienförmigen Thromben zukünftige translationale Forschung entolieren kann, beschreiben wir Techniken der NET-Identifikation und -Bewertung in paraffin-eingebetteten arteriellen Thromben bei Katzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung von NETs in festen kardiogenen arteriellen Thromben mit einem Doppel-Immunolabeling-Protokoll und einer Immunfluoreszenzmikroskopie. Obwohl nur kardiogene arterielle Thromben gefärbt wurden, konnte dieses Protokoll theoretisch für andere Thrombentypen und andere Tierarten verwendet werden. Die Identifizierung von NETs innerhalb des felinen arteriellen Thrombens deutet darauf hin, dass NETs bei Derene bei Katzen eine Rolle spielen können.
Der…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde von Mitteln der University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F) unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Kevin Woolard für den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops würdigen.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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