Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza
Summary
Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.
Abstract
Le trappole extracellulari neutrophil (NET), composte da DNA privo di cellule (cfDNA) e proteine come gli istoni e l’elastasi dei neutrofili (NE), vengono rilasciate dai neutrofili in risposta all’infiammazione sistemica o agli agenti patogeni. Anche se in precedenza i NET hanno dimostrato di aumentare la formazione di coaguli e inibire la fibrinolisi negli esseri umani e nei cani, il ruolo dei NET nei gatti con tromboembolismo arterioso cardiogenico (CATE), una complicazione pericolosa per la vita secondaria alla cardiomiopatia ipertrofica , non è noto. Un metodo standardizzato per identificare e quantificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici nei gatti farà progredire la nostra comprensione del loro ruolo patologico in CATE. Qui, descriviamo una tecnica per identificare i NET nei trombi di formaldeide-fissi e di paraffina-embedded all’interno della biforcazione aortica, estratta durante la necropsia. Dopo la deparaffinazione con lo xilene, le sezioni aortiche sono sottoposte al recupero indiretto dell’antigene indotto dal calore. Le sezioni sono state poi bloccate, permeabilizzate e i NET ex vivo sono stati identificati mediante la co-localizzazione del DNA privo di cellule (cfDNA), il citrullinato l’istone H3 (citH3) e l’elastasi neutrofila (NE) usando la microscopia immunofluoresce. Per ottimizzare l’immunorilevamento dei NET nei trombi, l’autofluorescenza degli elementi tissutali è stata limitata utilizzando un processo di spegnimento dell’autofluorescenza prima della microscopia. Questa tecnica potrebbe essere uno strumento utile per studiare NET e trombosi in altre specie e offre nuove intuizioni sulla fisiopatologia di questa complessa condizione.
Introduction
I gatti con cardiomiopatia ipertrofica sono a rischio di complicazioni tromboemboliche pericolose per la vita1,2. Nonostante l’elevata morbilità e mortalità associata al trombboembolismo arterioso cardiogenico felino (CATE), la fisiopatologia sottostante di CATE nei gatti è poco compresa. Ci sono anche strumenti diagnostici e terapeutici limitati per trattare e identificare i gatti a rischio di questa condizione devastante3.
Oltre al suo ruolo nell’immunità innata, i neutrofili hanno dimostrato di svolgere un ruolo nella trombosi rilasciando trappole extracellulari neutrofiche (NET), che sono reti simili a reti di DNA privo di cellule (cfDNA) incrostate di istoni e proteine granulari come elastasi neutrofili (NE) e mieloperossia. Neutrofili sottoposti formazione NETs in risposta all’infiammazione sistemica, incontro diretto con gli agenti patogeni, e l’interazione con piastrine attivate4,5,6,7. Nei cani, il DNA derivato dal neutrofia ha dimostrato di inibire la lisi del coagulo, mentre le proteine NET accelerano la formazione di coaguli. La capacità dei NET di intrappolare le cellule circolanti e i componenti di coagulazione è anche fondamentale per le loro proprietà trombogene8,9,10,11,12.
I NET sono rilevati dalla co-localizzazione di proteine neutrofili extracellulari, istoni e cfDNA. Per questo motivo, l’identificazione e la quantificazione di NET nei tessuti fissi mediante immunofluorescenza dei tessuti deparaffinati è superiore alla tradizionale ematossia (H&E) macchia utilizzando la microscopia a campo luminoso4,5. Diversi studi umani che utilizzano la microscopia immunofluorescenza hanno identificato i NET come componenti strutturali dei trombi coronarici, dei trombi dell’ictus cerebrale, dell’atrombromosi e dei trombi venosi13,14,15,16,17. Ad oggi, non è stato descritto un metodo standardizzato per rilevare e quantificare i NET nei trombi felini. Poiché l’identificazione dei NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini può facilitare la futura ricerca traslazionale in NET e trombosi, descriviamo tecniche di identificazione e valutazione della rete nei trombi arteriosi incorporati nella paraffina nei gatti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un protocollo per identificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi utilizzando un protocollo di doppia immunoetichettatura e la microscopia immunofluorescenza. Anche se solo i trombi arteriosi cardiogenici sono stati macchiati, in teoria questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie. L’identificazione di NET all’interno del trombbi arterioso felino suggerisce che i NET possono svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da fondi dell’Università della California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Gli autori vorrebbero riconoscere il Dr. Kevin Woolard per l’uso del microscopio a fluorescenza.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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