Identifikasjon av nøytrofile ekstracellulære feller i parafininnebygd feline arteriell trombi ved hjelp av immunofluorescens mikroskopi
Summary
Vi beskriver en metode for å identifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) i formaldehyd-fast og parafin-innebygd feline kardiogent arteriell trombe ved hjelp av varmeindusert antigen gjenfinning og en dobbel immunmerking protokoll.
Abstract
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), bestående av cellefritt DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og nøytrofile elastase (NE), frigjøres av nøytrofiler som svar på systemisk betennelse eller patogener. Selv om NETs tidligere har vist seg å forsterke koagulasjonsdannelse og hemme fibrinolyse hos mennesker og hunder, har netenes rolle hos katter med kardiogen arteriell tromboembolisme (CATE), en livstruende komplikasjon sekundær truende til hypertrofisk kardiomyopati , er ukjent. En standardisert metode for å identifisere og kvantifisere NETs i kardiogene arterielle trombi hos katter vil fremme vår forståelse av deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknikk for å identifisere NETs i formaldehyd-fast og parafininnebygd trombi innenfor aortabifurcation, ekstrahert under necropsy. Etter deparaffinisering med xylen gjennomgikk aortaseksjoner indirekte varmeindusert antigengjenfinning. Seksjoner ble deretter blokkert, permeabilisert, og ex vivo NETs ble identifisert ved kolokalisering av cellefri DNA (cfDNA), citrullinert histone H3 (citH3) og nøytrofile elastase (NE) ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi. For å optimalisere immundeteksjonen av NETs i trombi, ble autofluorescens av vevselementer begrenset ved hjelp av en autofluorescensssinfeksjonsprosess før mikroskopi. Denne teknikken kan være et nyttig verktøy for å studere NETs og trombose i andre arter og gir ny innsikt i patofysiologien til denne komplekse tilstanden.
Introduction
Katter med hypertrofisk kardiomyopati er i fare for livstruende tromboemboliske komplikasjoner1,2. Til tross for den høye sykelighet og dødelighet forbundet med feline kardiogent arteriell tromboembolisme (CATE), er den underliggende patofysiologien til CATE hos katter dårlig forstått. Det er også begrenset diagnostiske og terapeutiske verktøy for å behandle og identifisere katter i fare for denne ødeleggende tilstanden3.
I tillegg til sin rolle i medfødt immunitet, nøytrofiler har vist seg å spille en rolle i trombose ved å slippe nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), som er web-lignende nettverk av celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulære proteiner som nøytrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Nøytrofiler gjennomgår NETs formasjon som svar på systemisk betennelse, direkte møte med patogener og interaksjon med aktiverte blodplater4,,5,,6,7. Hos hunder har nøytrofilavledet DNA vist seg å hemme koagulasjonslyse, mens NET-proteiner akselererer koagulasjonsdannelse. NeTs evne til å fange sirkulerende celler og koagulasjonskomponenter er også nøkkelen til deres trombogene egenskaper8,,9,,10,,11,,12.
NETs oppdages ved samlokalisering av ekstracellulære nøytrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grunn av dette er identifisering og kvantifisering av NETs i faste vev ved immunofluorescens av deparaffinert vev bedre enn tradisjonell hematoksyslin og eosin (H&E) flekk ved hjelp av lyse feltmikroskopi4,5. Flere humane studier ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi identifisertNETer som strukturelle komponenter av koronararteriell trombi, cerebral hjerneslag trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Hittil er det ikke beskrevet en standardisert metode for å oppdage og kvantifisere NETs i feline trombi. Fordi identifisering av NETs i feline kardiogene arterielle trombi kan lette fremtidig translasjonell forskning i NETs og trombose, beskriver vi teknikker for NETTO identifikasjon og vurdering i parafininnebygd arteriell trombi hos katter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en protokoll for å identifisere NETs i fast feline kardiogent arteriell trombi ved hjelp av en dobbel immunmerking protokoll og immunofluorescens mikroskopi. Selv om bare kardiogene arterielle trombi ble farget, kan denne protokollen i teorien brukes til andre typer trombi og i andre veterinærarter. Identifikasjon av NETs innenfor feline arteriell trombi antyder at NETs kan spille en rolle i trombose hos katter.
Påvisning av NETs ved immunofluorescens i fast og parafininnebygd …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne ønsker å anerkjenne Dr. Kevin Woolard for bruk av fluorescensmikroskopet.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
Riferimenti
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
