Summary

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Abstract

Le trappole extracellulari neutrophil (NET), composte da DNA privo di cellule (cfDNA) e proteine come gli istoni e l’elastasi dei neutrofili (NE), vengono rilasciate dai neutrofili in risposta all’infiammazione sistemica o agli agenti patogeni. Anche se in precedenza i NET hanno dimostrato di aumentare la formazione di coaguli e inibire la fibrinolisi negli esseri umani e nei cani, il ruolo dei NET nei gatti con tromboembolismo arterioso cardiogenico (CATE), una complicazione pericolosa per la vita secondaria alla cardiomiopatia ipertrofica , non è noto. Un metodo standardizzato per identificare e quantificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici nei gatti farà progredire la nostra comprensione del loro ruolo patologico in CATE. Qui, descriviamo una tecnica per identificare i NET nei trombi di formaldeide-fissi e di paraffina-embedded all’interno della biforcazione aortica, estratta durante la necropsia. Dopo la deparaffinazione con lo xilene, le sezioni aortiche sono sottoposte al recupero indiretto dell’antigene indotto dal calore. Le sezioni sono state poi bloccate, permeabilizzate e i NET ex vivo sono stati identificati mediante la co-localizzazione del DNA privo di cellule (cfDNA), il citrullinato l’istone H3 (citH3) e l’elastasi neutrofila (NE) usando la microscopia immunofluoresce. Per ottimizzare l’immunorilevamento dei NET nei trombi, l’autofluorescenza degli elementi tissutali è stata limitata utilizzando un processo di spegnimento dell’autofluorescenza prima della microscopia. Questa tecnica potrebbe essere uno strumento utile per studiare NET e trombosi in altre specie e offre nuove intuizioni sulla fisiopatologia di questa complessa condizione.

Introduction

I gatti con cardiomiopatia ipertrofica sono a rischio di complicazioni tromboemboliche pericolose per la vita1,2. Nonostante l’elevata morbilità e mortalità associata al trombboembolismo arterioso cardiogenico felino (CATE), la fisiopatologia sottostante di CATE nei gatti è poco compresa. Ci sono anche strumenti diagnostici e terapeutici limitati per trattare e identificare i gatti a rischio di questa condizione devastante3.

Oltre al suo ruolo nell’immunità innata, i neutrofili hanno dimostrato di svolgere un ruolo nella trombosi rilasciando trappole extracellulari neutrofiche (NET), che sono reti simili a reti di DNA privo di cellule (cfDNA) incrostate di istoni e proteine granulari come elastasi neutrofili (NE) e mieloperossia. Neutrofili sottoposti formazione NETs in risposta all’infiammazione sistemica, incontro diretto con gli agenti patogeni, e l’interazione con piastrine attivate4,5,6,7. Nei cani, il DNA derivato dal neutrofia ha dimostrato di inibire la lisi del coagulo, mentre le proteine NET accelerano la formazione di coaguli. La capacità dei NET di intrappolare le cellule circolanti e i componenti di coagulazione è anche fondamentale per le loro proprietà trombogene8,9,10,11,12.

I NET sono rilevati dalla co-localizzazione di proteine neutrofili extracellulari, istoni e cfDNA. Per questo motivo, l’identificazione e la quantificazione di NET nei tessuti fissi mediante immunofluorescenza dei tessuti deparaffinati è superiore alla tradizionale ematossia (H&E) macchia utilizzando la microscopia a campo luminoso4,5. Diversi studi umani che utilizzano la microscopia immunofluorescenza hanno identificato i NET come componenti strutturali dei trombi coronarici, dei trombi dell’ictus cerebrale, dell’atrombromosi e dei trombi venosi13,14,15,16,17. Ad oggi, non è stato descritto un metodo standardizzato per rilevare e quantificare i NET nei trombi felini. Poiché l’identificazione dei NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini può facilitare la futura ricerca traslazionale in NET e trombosi, descriviamo tecniche di identificazione e valutazione della rete nei trombi arteriosi incorporati nella paraffina nei gatti.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso l’Università della California, Davis. Necropsie e biopsie dei tessuti sono state eseguite con il consenso dei proprietari. 1. Fissaggio, incorporamento e sezionamento dei tessuti Dissezionare la biforcazione aortica, tra cui l’aorta discendente, l’arteria femorale e le arterie iliache comuni(Figura 1A), poc…

Representative Results

Utilizzando questo protocollo per la deparaffinizzazione, il recupero di antigeni indotti dal calore e la doppia immunoetichettatura dei trombi incorporati nella paraffina, abbiamo identificato per la prima volta i NET in felino CATE. I trombi all’interno della biforcazione aortica sono stati localizzati mediante microscopia a fluorescenza e microscopia a campo luminoso utilizzando la colorazione H&E standard e la microscopia a contrasto di fase. Sulla microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini consistevano …

Discussion

Descriviamo un protocollo per identificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi utilizzando un protocollo di doppia immunoetichettatura e la microscopia immunofluorescenza. Anche se solo i trombi arteriosi cardiogenici sono stati macchiati, in teoria questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie. L’identificazione di NET all’interno del trombbi arterioso felino suggerisce che i NET possono svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti.

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto da fondi dell’Università della California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Gli autori vorrebbero riconoscere il Dr. Kevin Woolard per l’uso del microscopio a fluorescenza.

Materials

4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

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