Summary

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.

Abstract

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), bestehend aus zellfreier DNA (cfDNA) und Proteinen wie Histonen und neutrophiler Elastase (NE), werden von Neutrophilen als Reaktion auf systemische Entzündungen oder Krankheitserreger freigesetzt. Obwohl NETs bisher gezeigt haben, dass sie die Gerinnselbildung verstärken und die Fibrinolyse bei Menschen und Hunden hemmen, ist die Rolle von NETs bei Katzen mit kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE), einer lebensbedrohlichen Komplikation, die zur hypertrophen Kardiomyopathie sekundär ist. , ist unbekannt. Eine standardisierte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von NETs in kardiogenen arteriellen Thromben bei Katzen wird unser Verständnis ihrer pathologischen Rolle in CATE fördern. Hier beschreiben wir eine Technik zur Identifizierung von NETs in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten Thromben innerhalb der Aortenverzweigung, die während der Nekropsie extrahiert wird. Nach der Deparaffinierung mit Xylol wurden Aortenschnitte indirekt wärmeinduzierte Antigenabrufungen unterzogen. Abschnitte wurden dann blockiert, permeabilisiert, und ex vivo NETs wurden durch Kolokalisierung von zellfreier DNA (cfDNA), citrulliniertem Histon H3 (citH3) und neutrophiler Elastase (NE) mittels Immunfluoreszenzmikroskopie identifiziert. Um die Immundetektion von NETs in Thromben zu optimieren, wurde die Autofluoreszenz von Gewebeelementen durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenching-Verfahrens vor der Mikroskopie eingeschränkt. Diese Technik könnte ein nützliches Werkzeug sein, um NETs und Thrombose bei anderen Arten zu studieren und bietet neue Einblicke in die Pathophysiologie dieses komplexen Zustandes.

Introduction

Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie sind dem Risiko lebensbedrohlicher thromboembolischer Komplikationen1,2ausgesetzt. Trotz der hohen Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit fein kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE) ist die zugrunde liegende Pathophysiologie von CATE bei Katzen schlecht verstanden. Es gibt auch begrenzte diagnostische und therapeutische Instrumente zur Behandlung und Identifizierung von Katzen, die von diesem verheerenden Zustand bedroht sind3.

Zusätzlich zu seiner Rolle bei der angeborenen Immunität haben Neutrophilen gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Thrombose spielen, indem sie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen, die webartige Netzwerke zellfreier DNA (cfDNA) sind, die mit Histonen und granulären Proteinen wie Neutrophilenase (NE) und Myeloperoxidase verkrustet sind. Neutrophile durchlaufen NETs Bildung als Reaktion auf systemische Entzündung, direkte Begegnung mit Krankheitserregern, und Interaktion mit aktivierten Blutplättchen4,5,6,7. Bei Hunden, neutrophil-abgeleitete DNA hat sich gezeigt, dass GerinnselLyse hemmen, während NET-Proteine die Gerinnselbildung beschleunigen. Die Fähigkeit von NETs, zirkulierende Zellen und Gerinnungskomponenten zu fangen, ist auch der Schlüssel zu ihren thrombogenen Eigenschaften8,9,10,11,12.

NETs werden durch Kolokalisierung von extrazellulären neutrophilen Proteinen, Histonen und cfDNA nachgewiesen. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Quantifizierung von NETs in festen Geweben durch Immunfluoreszenz von deparaffiniertem Gewebe dem traditionellen Hämatoxylin- und Eosinfleck (H&E) mit Hellfeldmikroskopie4,5überlegen. Mehrere Studien am Menschen mit Immunfluoreszenzmikroskopie identifizierten NETs als strukturelle Komponenten von koronaren arteriellen Thromben, zerebralen Schlaganfall-Thromben, Atherothrombose und venösem Thrombi13,14,15,16,17. Bis heute wurde eine standardisierte Methode zur Erkennung und Quantifizierung von NETs in Katzenthromben nicht beschrieben. Da die Identifizierung von NETs in transinenkardiinen arterienförmigen Thromben zukünftige translationale Forschung entolieren kann, beschreiben wir Techniken der NET-Identifikation und -Bewertung in paraffin-eingebetteten arteriellen Thromben bei Katzen.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis, durchgeführt. Nekropsien und Biopsien von Geweben wurden mit Zustimmung der Eigentümer durchgeführt. 1. Gewebefixierung, Einbettung und Schnitt Dissect out der aortenbifurkation, einschließlich der absteigenden Aorta, Femoralarterie, und die gemeinsamen Iliasarterien (Abbildung 1A), ku…

Representative Results

Mit diesem Protokoll zur Deparaffinierung, wärmeinduzierten Antigenabruf ungegnet und doppelte Immunkennzeichnung von Paraffin-eingebettetem Thromben identifizierten wir neTs zum ersten Mal in feline CATE. Thrombi innerhalb der aortenigen Bifurkation wurden durch Fluoreszenzmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mittels Standard-H&E-Färbung und Phasenkontrastmikroskopie lokalisiert. Bei der Hellfeldmikroskopie bestand der transinale arterielle Thrombi aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen (<stro…

Discussion

Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung von NETs in festen kardiogenen arteriellen Thromben mit einem Doppel-Immunolabeling-Protokoll und einer Immunfluoreszenzmikroskopie. Obwohl nur kardiogene arterielle Thromben gefärbt wurden, konnte dieses Protokoll theoretisch für andere Thrombentypen und andere Tierarten verwendet werden. Die Identifizierung von NETs innerhalb des felinen arteriellen Thrombens deutet darauf hin, dass NETs bei Derene bei Katzen eine Rolle spielen können.

Der…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Studie wurde von Mitteln der University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F) unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Kevin Woolard für den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops würdigen.

Materials

4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate ThermoFisher Scientific Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x ThermoFisher Scientific AMEP4681 NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x ThermoFisher Scientific AMEP4682 NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x ThermoFisher Scientific AMEP4699 NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher Scientific Catalog # A32723
Goat serum Jackson Immuno Research Labs Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody Bioss Antibodies Bs-6982R-Biotin Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40 Pierce Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides Thomas Scientific Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum Life Technology Catalog # 10510
Target Retrieval Solution Agilent Dako S2367 TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit Vector Laboratories SP-8400

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (157), e60834, doi:10.3791/60834 (2020).

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