Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.
L’étude de multiples modifications post-traductionnelles (PTM) des protéines est une étape cruciale pour comprendre le travesti PTM et obtenir des informations plus holistiques sur la fonction protéique. Malgré l’importance des études d’enrichissement multi-PTM, peu d’études étudient plus d’un PTM à la fois, en raison en partie des dépenses, du temps, et de grandes quantités de protéines nécessaires pour effectuer l’analyse protéomique globale multiple des PTM. L’enrichissement d’affinité « un pot » détaillé dans ce protocole permet l’identification simultanée et la quantification des peptides avec des résidus de lysine contenant des PTM d’acétylation et de succinylation avec de faibles quantités d’échantillons Entrée. Le protocole comprend la préparation du lysate protéique à partir des foies de souris des souris KNOCK SIRT5, la performance de la digestion de la trypsine, l’enrichissement des PTM et la performance de l’analyse spectrométrique de masse à l’aide d’un flux de travail d’acquisition indépendant de données (DIA). Parce que ce flux de travail permet l’enrichissement de deux PTM à partir d’un même échantillon simultanément, il fournit un outil pratique pour étudier PTM crosstalk sans nécessiter de grandes quantités d’échantillons, et il réduit considérablement le temps nécessaire pour la préparation de l’échantillon, les données l’acquisition et l’analyse. La composante DIA du flux de travail fournit des informations complètes spécifiques au PTM. Ceci est particulièrement important lors de l’étude de la localisation des sites PTM, car LE DIA fournit des ensembles complets d’ions fragmentaires qui peuvent être déchiffrés par calcul pour différencier les différents isoformes de localisation PTM.
Une myriade de modifications post-traductionnelle régulent dynamiquement les protéines et les voies par des effets sur l’activité1, signalant2, et le chiffre d’affaires3,4. Par exemple, les kinases protéiques sont activées ou désactivées par l’ajout de groupes de phosphate5, et l’acétylation histone et d’autres modifications fournissent un mécanisme pour changer la structure de la chromatine et servir de mécanismes de régulation transcriptionnel6,7. Ces dernières années, les preuves ont monté que plusieurs PTM travaillent de concert ou en concurrence pour réguler la fonction de protéine ou l’activité8,9,10,11. Par conséquent, la compréhension de ptM crosstalk est un besoin émergent dans la recherche de PTM. Cependant, la plupart des flux de travail protéomiques disponibles pour identifier et quantifier les sites PTM se concentrent sur des modifications uniques, plutôt que sur l’interaction de multiples modifications. Le flux de travail décrit corrèle la modification spécifique des protéines « points chauds » et les résidus de lysine qui sont modifiés par plusieurs PTM différents.
Il y a un besoin croissant dans la communauté scientifique pour des méthodes réalisables pour étudier plusieurs PTM simultanément12. La plupart des méthodes pour identifier et quantifier globalement les sites de plusieurs types de PTM sont difficiles en raison des coûts élevés et de la quantité de tissu requis12,13. Non seulement les expériences d’enrichissement multiPTM prennent beaucoup de temps en termes de préparation d’échantillons, d’acquisition de données et d’analyse de données, mais ces études nécessitent généralement des quantités importantes et souvent prohibitives de protéines11. Décrit ici est un protocole pour l’enrichissement simultané et l’analyse de plusieurs PTM, qui aborde également plusieurs de ces obstacles et permet le profilage à grande échelle PTM et l’évaluation des traques croisées entre les différents PTM14. Ce flux de travail d’un pot décrit une façon pratique pour les chercheurs biomédicaux de profiler à l’échelle mondiale plusieurs PTM, d’identifier les peptides co-modifiés et d’étudier le traqueur PTM d’une manière efficace et rentable14,15.
Ici, cette méthode est présentée en examinant l’acylation des protéines mitochondriales, qui a été étudiée pour la première fois il y a plus de 50 ans16. Il se concentre spécifiquement sur l’acétylation de lysine17 et la succinylation18, y compris la co-occurrence de ces modifications sur les protéines et même la co-modification au niveau peptidique. Étant donné que l’étude utilise un modèle de souris à élimination directe sirtuine 5 (SIRT5), elle a été choisie pour se concentrer sur l’enrichissement des sites d’acétylation et de succinylation. Cette décision a été prise parce que les sites de succinylation sont des cibles de SIRT5 desuccinylase et sont donc censés montrer une upregulation significative chez les souris KO, ce qui en fait les PTM les plus pertinents dans ce cas. Les deux PTM sont biologiquement pertinents comme l’ont récemment résumé Carrico et coll.19. En général, l’acétylation montre des effets importants sur l’expression des gènes et le métabolisme, et la succinylation a été rapportée pour réguler le métabolisme cardiaque et la fonction20.
Le protocole décrit peut être exécuté avec une faible quantité de matière d’entrée de protéine (par exemple, 1 mg de lysate protéique) et réduit la durée totale de l’expérience en réduisant le temps passé pour le traitement de l’échantillon, l’acquisition de la SP et l’analyse des données. Un schéma de flux de travail est fourni à la figure 1. Nous avons également utilisé des quantités encore plus faibles de matière de départ (jusqu’à 100 g de lysate protéique, réduisant les quantités de perles utilisées en conséquence), ce qui, comme prévu, réduit le rendement global des peptides acylés identifiés; cependant, il fournit toujours des résultats très précieux et des peptides acylated quantifiables.
Bien que les workflows dits descendantou intermédiaire n’utilisent généralement pas d’approches de digestion protéolytique (et maintiennent ainsi la connectivité de plusieurs PTM au sein d’une protéine), ce protocole se concentre sur une approche d’enrichissement d’affinité basée sur le peptide afin d’acquérir une profondeur et une sensibilité supplémentaires pour l’identification et la quantification du PTM (figure 1). En outre, ce flux de travail centré sur le peptide utilise des méthodes modernes de spectrométrie de masse, y compris 1) une combinaison d’acquisition dépendante des données (DDA) pour générer des bibliothèques spectrales, et 2) l’acquisition indépendante des données (DIA) pour une quantification précise de PTM dans un flux de travail sans étiquette.
Les flux de travail DIA surmontent la stochasticité de l’échantillonnage des schémas d’analyse typiques du PDD en fragmentant de façon exhaustive tous les signaux peptidiques dans la plage de m/z échantillonnée21. Cette fonctionnalité est également extrêmement bénéfique en termes de localisation du site, car il est plus facile d’obtenir des informations sur les ions fragmentaires spécifiques sont modifiés dans le peptide. En outre, les flux de travail DIA permettent l’identification et la quantification des isoformes PTM-peptide mineurs avec des ions précurseurs identiques. Les méthodes DE DIA peuvent également déterminer une localisation spécifique du site PTM au sein d’un peptide en fonction d’ions fragmentés correspondants spécifiques qui sont mesurés en tout temps de manière exhaustive. Cependant, les approches DDA utilisent souvent des caractéristiques d’« exclusion dynamique » qui excluent l’échantillonnage multiple de la SP/MS pour le même ion précurseur, manquant ainsi des isoformes PTM mineurs.
La stratégie d’enrichissement simultané décrite ici est idéalepour les études qui bénéficieront du profilage et de la quantification globaux de plusieurs PTM, de l’examen du travestissement ptM et de la compréhension des interactions dynamiques des modifications post-traductionnelles. L’identification de multiples PTM enrichis dans un flux de travail combiné a été décrite par : l’enrichissement global, en série ou parallèle de PTM contenant des peptides protéolytiques, ou alternativement par l’analyse des protéines intactes. En comparaison directe avec l’enrichissement en série de l’acétylation et de la succinylation, l’efficacité de la méthodologie d’un pot a été établie comme étant très similaire14. Ces protocoles alternatifs exigent des quantités importantes de matériel de départ et de temps et peuvent être prohibitifs. En revanche, le protocole d’un pot fournit une méthode peu coûteuse et efficace pour l’enrichissement de plus d’un PTM avec l’analyse et l’identification ultérieures.
Les tissus hépatiques de souris sont obtenus à partir de souris KNOCK SIRT5 et sont utilisés ici comme matériau de départ. Ce protocole peut également être réalisé pour les lysates protéiques provenant de différents tissus ou d’expériences de culture cellulaire. Ce protocole peut être appliqué aux lysates protéiques obtenus à partir de tissus ou de granulés de culture cellulaire.
Ce protocole décrit une technique nouvelle pour l’enrichissement simultané multiple de PTM pour mieux comprendre le crosstalk de PTM. Les méthodes alternatives pour atteindre cet objectif ont tendance à être excessivement longues et coûteuses, et elles nécessitent de grandes quantités de protéines pour réussir11,13. Ce protocole présente un flux de travail d’enrichissement multi-PTM qui implique l’incubation dans des perles conjuguées par anticorps pour deux PTM à la fois pour améliorer l’efficacité globale de l’expérience. Cette méthode implique également l’utilisation du PDD pour la génération spectrale de bibliothèques et les acquisitions de MS DIA pour détecter et quantifier les peptides présents avec une interférence réduite des ionsfragment2,23. Les logiciels, tels que les moteurs de recherche de base de données MS, sont utilisés pour analyser et quantifier les données des acquisitions de PDD, tandis que Quantitative Proteomics Software24 et DIA Quantitative Analysis Software25 sont nécessaires pour interpréter les spectres complexes produits par les acquisitions de DIA.
Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole qui doivent être suivies avec soin. Comme l’objectif principal du protocole est d’enrichir simultanément plusieurs PTM, l’étape d’enrichissement de l’affinité anticorps (section 2) est essentielle au succès de l’expérience. Lors de l’exécution des lavages sur les perles, il est nécessaire de s’assurer qu’aucune des perles sont aspirées accidentellement. Il est également nécessaire de s’assurer que la concentration d’urée a été diluée à 1 M avant la digestion avec la trypsine (étape 1.8). Bien que l’urée de 8 M soit nécessaire plus tôt dans le protocole pour la solubilité des protéines, les concentrations d’urée supérieures à 1 M inhiberont l’activité enzymatique de la trypsine. En outre, il est important de vérifier systématiquement le pH de l’échantillon tout au long du protocole. Ceci est particulièrement important avant la digestion. Si le pH de l’échantillon et la solution de trypsine ne sont pas neutralisés de manière appropriée avant l’incubation, il peut entraîner une digestion inefficace dans laquelle de nombreux sites de clivage peuvent être manqués, ce qui entraîne moins d’identifications peptidiques.
Quelques modifications au protocole peuvent être utiles lors de la préparation d’échantillons. Pour un lysate protéique acheté à partir de 1 mg de matériau de départ, un quart des perles d’anticorps fournies dans chaque tube de balayage PTM peut être utilisé comme une alternative rentable. Une plus grande quantité de matériel de départ peut être utilisée pour de meilleurs résultats, tant que la quantité de perles d’anticorps utilisées sont augmentées proportionnellement. Une autre modification qui peut améliorer le flux de travail est de digérer les échantillons avec une autre protéase en plus de la trypsine. Cette modification entraînerait une plus grande variabilité dans les peptides clivés, offrant une couverture accrue des résidus de protéines. Bien que non nécessaire, il est recommandé que la trypsine soit l’une des enzymes utilisées pour l’analyse PTM en raison de sa spécificité de clivage élevé26.
Une limitation de ce protocole est que les PTM à l’étude doivent avoir des chimies similaires afin d’être enrichis simultanément14. Les procédures pour les différentes perles conjuguées par anticorps doivent être similaires, en utilisant des solvants et des solutions similaires, y compris des conditions d’élution similaires, et de préférence du même fournisseur. Pour cette raison, la méthode décrite ici utilise systématiquement l’acétylation et la succinylation comme exemple, qui utilisent tous deux des perles conjuguées par anticorps (Cell Signaling Technology, Inc). Bien que cette méthode puisse théoriquement être appliquée à n’importe quel nombre de PTM, des études supplémentaires seraient nécessaires pour évaluer la limitation exacte du protocole à cet égard. En outre, comme il s’agit d’une méthode d’enrichissement à base d’anticorps, la méthode ne peut fournir qu’une quantification relative des sites PTM.
En comparaison avec les méthodes d’enrichissement multi-PTM existantes, ce flux de travail est une alternative plus faisable et plus rentable. De cette expérience, il a été observé que l’efficacité de cette méthode se compare extrêmement bien avec des méthodes alternatives, telles que les enrichissements individuels ou en série. La figure 2B montre que le CV médian pour les zones de pic de peptides modifiés a en fait été diminué dans la méthode d’un pot par rapport aux enrichissements à un seul PTM et aux enrichissements en série-PTM13. Nous avons analysé en outre les résultats expérimentaux évaluant les quantifications au niveau du site pour l’acétylation ou la succinylation. De plus, l’analyse de corrélation de Spearman (figure 2C,D) a démontré que l’enrichissement en PTM d’un seul pot a été exécuté de la même façon que les workflows d’enrichissement d’un seul PTM. Cela était également vrai pour les corrélations peptides et fragment-niveau. La même observation a tenu pour chacun des trois corrélations en comparant un pot avec l’enrichissement de série-PTM.
Ce protocole permet aux chercheurs de faire des connaissances biologiques fascinantes sur les traques ptM d’une manière rapide et rentable. La composante DIA du flux de travail permet aux chercheurs de mieux comprendre les PTM, car il fournit des informations sur la localisation des sites et surmonte les défis tels que le faible taux d’occupation des PTM. Les ions précurseurs ont tendance à être exclus du PDD, ce qui est particulièrement important lorsqu’ils étudient les PTM, car l’occupation du site est souvent faible au point que ces peptides ne sont pas sélectionnés pour la SP/MS, mais contiennent toujours des informations cruciales. Des expériences de suivi pourraient être effectuées pour évaluer la limite supérieure du nombre de PTM pouvant être enrichis simultanément à l’aide de cette méthode. Une amélioration future de ce flux de travail pourrait inclure le développement de plates-formes logicielles plus avancées pour automatiser davantage l’analyse de la localisation du site et de l’occupation du site PTM.
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons le soutien de la subvention d’instrumentation partagée des NIH pour le système TripleTOF à l’Institut Buck (1S10 OD016281). Ce travail a également été soutenu par le National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 à B.S.) et l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (R24 DK085610 à Eric Verdin; R01 DK090242 à Eric Goetzman). X.X. a reçu l’appui d’une subvention des National Institutes of Health (subvention des NIH T32GM8806, à Judith Campisi et Lisa Ellerby), au Nouveau-B.), grâce à une bourse postdoctorale de la Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |