此工作流程描述了用于定量全球蛋白质组分析的多个蛋白质转化后修饰 (PTM) 的及时且经济高效的扩充性能。该协议利用肽级PTM富集与多个结合抗体,然后数据独立的采集质谱分析,以获得对PTM串扰的生物见解。
研究蛋白质的多种翻译后修饰 (PTM) 是了解 PTM 串扰和获得对蛋白质功能更全面的见解的关键步骤。尽管多PTM浓缩研究很重要,但很少有研究一次调查一个以上PTM,部分原因是对PTM进行多个全球蛋白质组分析所需的费用、时间和大量蛋白质。本议定书中详述的”单锅”亲亲浓缩克服了这些障碍,允许同时识别和定量含有乙酰化基质和琥珀化的样品含量低的裂解物残留物的肽输入。该协议涉及从SIRT5敲除小鼠小鼠肝脏制备蛋白质解结物、胰蛋白酶消化性能、PTM富集以及使用数据独立采集(DIA)工作流程进行质谱分析。由于此工作流允许同时从同一样品中丰富两个 PTM,因此它提供了一个实用的工具,无需大量样品即可研究 PTM 串扰,并大大减少了样品制备、数据所需的时间采集和分析。工作流的 DIA 组件提供特定于 PTM 的全面信息。这在研究 PTM 站点定位时尤其重要,因为 DIA 提供了全面的片段离子集,这些片段离子可以计算破译,以区分不同的 PTM 定位等形。
无数的翻译后修饰通过对活性1、信号2和周转率3、4的影响,动态调节蛋白质和通路。例如,蛋白质激酶通过加入磷酸盐组5激活或停用,而组蛋白乙酰化和其他修饰提供了改变染色质结构的机制,并用作转录调节机制6,7。近年来,越来越多的证据表明,多个PTM协同工作或竞争调节蛋白质功能或活动8,9,10,11。因此,理解PTM串扰是PTM研究的一个新兴需求。但是,大多数用于识别和量化 PTM 站点的蛋白组工作流侧重于单个修改,而不是多个修改的相互作用。所述工作流程将特定蛋白质修饰”热点”和经多个不同 PTM 修饰的流因为素残留物相关联。
科学界越来越需要可行的方法,同时研究多个PTM。大多数全球识别和量化多种类型的PTM的部位的方法都是具有挑战性的,因为高成本和数量所需的组织12,13。多PTM浓缩实验不仅在样品制备、数据采集和数据分析方面非常耗时,而且这些研究通常需要大量且往往令人望而却步的蛋白质11。此处描述的是同时丰富和分析多个 PTM 的协议,该协议还解决了其中的几个障碍,并支持大规模 PTM 分析和评估各种 PTM14之间的串扰。这个单罐工作流程概述了生物医学研究人员在全球范围内分析多个PTM、识别共修改肽以及以高效且经济高效的方式研究PTM串扰的实用方法。
在这里,这种方法是通过检查线粒体蛋白消融来展示的,这是50多年前首次研究的。它特别集中在裂化乙酰化17和琥珀化18,包括这些修饰在蛋白质上的共同发生,甚至在肽水平上共同修饰。由于该研究使用sirtuin 5(SIRT5)敲除小鼠模型,因此选择该模型侧重于乙酰化浓缩和渗化位点。作出这一决定是因为渗出位点是SIRT5解奇酶的目标,因此预计在KO小鼠中会显示出显著的调节,使它们成为本案中最相关的PTM。正如Carrico等人最近总结的那样,这两种PTM在生物学上都相关。一般来说,乙酰化对基因表达和代谢有重要影响,而渗氧体菌被报告调节心脏代谢和功能20。
所述协议可以使用少量的蛋白质输入材料(例如 1 mg 的蛋白质莱沙)执行,并通过减少样品处理、MS 采集和数据分析所花费的时间来缩短实验的总持续时间。图 1中提供了工作流原理图。我们还使用了更低数量的起始材料(降低100μg的蛋白质裂化物,相应减少使用的珠子量),这降低了已识别的囊化肽的总体产量;然而,它仍然提供非常有价值的结果和可量化的化囊化肽。
虽然所谓的自上而下或中下工作流程通常不使用蛋白解体消化方法(从而维持一种蛋白质内多个 PTM 的连接),但该协议侧重于基于肽的亲和扩增方法,以获得 PTM 鉴定和定量的额外深度和灵敏度(图 1)。此外,这种以肽为中心的工作流程采用现代质谱法,包括 1) 数据依赖性采集 (DDA) 组合以生成光谱库,2) 数据无关采集 (DIA),用于在无标签工作流中精确进行 PTM 量化。
DIA工作流程通过全面分割采样m/z范围内的所有肽信号21,克服了典型DDA扫描方案的采样分析。此功能在站点定位方面也非常有益,因为它更容易获得有关肽内哪些特定片段离子被修饰的信息。此外,DIA工作流程允许识别和定量具有相同前体离子的轻微PTM-肽等形。DIA 方法还可以根据在任何时候都全面测量的特定相应片段离子确定肽内的特定 PTM 位点定位。然而,DDA方法通常利用”动态排除”功能,排除同一前体子的MS/MS的多个采样,从而缺少轻微的PTM等形。
此处描述的同步扩充策略非常适合受益于多个 PTM 的全球分析和量化、检查 PTM 串扰和理解翻译后修改的动态交互的研究。在一个组合工作流程中,多个富集的PTM的识别已经描述通过:含有蛋白解酶肽的PTM的全局、串行或平行富集,或者通过分析完整的蛋白质。与乙酰化、渗化的连续富集直接比较,将单锅法的效能确定为非常相似的14。这些替代协议需要大量的起始材料和时间,而且成本可能过高。相反,单罐协议提供了一种廉价而高效的方法,用于通过后续分析和识别来浓缩多个 PTM。
小鼠肝脏组织从SIRT5敲除小鼠获得,并在这里用作起始材料。该协议也可以执行蛋白质乳酸从不同的组织或细胞培养实验。该协议可应用于从组织或细胞培养颗粒获得的蛋白质乳酸。
该协议描述了一种同时进行多个 PTM 扩充的新技术,以更有效地理解 PTM 串扰。实现这个目标的替代方法往往非常耗时和昂贵,它们需要大量的蛋白质才能成功。该协议提出了一种多PTM浓缩工作流程,涉及同时为两个PTM的抗体结合珠进行孵育,以提高实验的整体效率。该方法还涉及使用DDA进行光谱库生成和DIA MS采集,以检测和量化存在的肽,同时减少片段离子22、23的干扰。软件程序,如MS数据库搜索引擎用于分析和量化来自DDA收购的数据,而定量蛋白质组学软件24和特定的DIA定量分析软件25是解释DIA收购产生的复杂光谱所必需的。
在此协议中,应谨慎执行几个关键步骤。由于该协议的主要目标是同时为多个PTM进行扩充,抗体亲性浓缩步骤(第2节)对实验的成功至关重要。在珠子上进行分部时,必须确保没有珠子意外吸气。在用胰蛋白酶消化之前,确保尿素浓度已稀释至1M(步骤1.8)也是必要的。虽然在蛋白质溶解协议早期需要8M尿素,但尿素浓度超过1M会抑制胰蛋白酶的酶活性。此外,在整个协议中始终如一地检查样品的pH值也是很重要的。这在消化之前尤其重要。如果样品的pH值和胰蛋白酶溶液在孵育前未适当中和,则可能导致消化效率低下,其中可能错过许多裂解位点,导致肽识别较少。
在准备示例时,对协议进行一些修改可能会有所帮助。对于从 1 mg 起始材料中采购的蛋白质解结物,每个 PTM 扫描管中提供的四分之一的抗体珠可用作经济高效的替代物。只要使用的抗体珠量按比例增加,就可以使用更多的起始材料来取得更好的效果。另一个可以增强工作流程的修改是,除了胰蛋白酶之外,还可以用另一种蛋白酶来消化样品。这种修饰将导致被裂化的肽更具变异性,从而增加蛋白质残留物的覆盖率。虽然没有必要,但建议胰蛋白酶是PTM分析的酶之一,因为它的裂解特异性高26。
该协议的一个局限性是,正在研究的PTM需要有类似的化学成分,以便同时丰富14。不同抗体结合珠子的程序必须相似,使用类似的溶剂和溶液,包括类似的洗脱条件,最好来自同一供应商。因此,本文概述的方法始终以乙酰化化和渗化为例,两者都使用抗体结合的珠子(细胞信号技术,Inc)。虽然这种方法理论上可以适用于任意数量的PTM,但还需要进行更多的研究,以评估议定书在这方面的确切限制。此外,由于这是一种基于抗体的扩充方法,该方法只能提供PTM位点的相对定量。
与现有的多PTM浓缩方法相比,该工作流是一种更可行、更经济的替代方案。通过实验,观察到这种方法的功效与替代方法(如单一或串行浓缩)相比非常好。图2B显示,与单PTM浓缩和串行PTM富集13相比,单锅法中修饰肽峰区的中值CV实际上有所下降。进一步分析了评价乙酰化或渗化的位位定量的实验结果。此外,Spearman 相关性分析(图 2C,D) 表明单罐 PTM 富集与单 PTM 浓缩工作流类似。肽和片段级相关性也是如此。在比较单罐与串行-PTM富集时,所有三个相关性都持有相同的观察。
该协议允许研究人员快速、经济高效地对 PTM 串扰进行引人入胜的生物学见解。工作流程的DIA组件使研究人员能够更多地了解PTM,因为它提供有关站点本地化的信息,并克服了诸如PTM网站占用率低等挑战。 前体离子往往被DDA排除,这在研究PTM时尤其重要,因为站点占用率通常很低,无法为MS/MS选择,但仍包含重要信息。可以进行后续实验,以评估使用此方法可以同时丰富多少 PTM 的上限。此工作流的未来改进可能包括开发更高级的软件平台,以进一步自动化站点本地化和 PTM 站点占用的分析。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 NIH 对巴克研究所 (1S10 OD016281) 的 TripleTOF 系统共享仪器支持。这项工作还得到了国家过敏和传染病研究所(R01 AI108255 至 B.S.)和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(R24 DK0085610 至 Eric Verdin)的支持;R01 DK090242 给埃里克·戈茨曼)。X.X.得到国家卫生研究院(NIH赠款T32GM8806,给朱迪思·坎皮西和丽莎·埃勒比)的资助,N.B.得到了格伦医学研究基金会的博士后奖学金的支持。
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |