Summary

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Published: December 07, 2019
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Summary

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Abstract

Invasive Lungeninfektion durch den Schimmel Aspergillus fumigatus stellt eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten dar. Inhalierte Pilzkonidien (Sporen) werden von den menschlichen Lungenalveolen durch angeborene Monozyten und/oder Neutrophile phagozytoisiert. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Messung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie mit Fluorescein isothiocyanat (FITC)-markierten Conidie nativ für die Ko-Inkubation mit menschlichen Leukozyten und anschließende Gegenfärbung mit einem Anti-FITC-Antikörper, um eine Diskriminierung von internalisiertem und zellhaftem Konidien zu ermöglichen. Wesentliche Vorteile dieses Protokolls sind seine Schnelligkeit, die Möglichkeit, den Assay mit der zytometrischen Analyse anderer Zellmarker von Interesse zu kombinieren, die gleichzeitige Analyse von Monozyten und Neutrophilen aus einer einzigen Probe und seine Anwendbarkeit auf andere zellwandtragende Pilze oder Bakterien. Die Bestimmung der Prozentsätze von Phagozytosing-Leukozyten bietet Mikrobiologen ein Mittel zur Beurteilung der Virulenz eines Erregers oder zum Vergleich von Pathogenwildarten und Mutanten sowie Immunologen zur Untersuchung der Fähigkeiten menschlicher Leukozyten zur Bekämpfung von Krankheitserregern.

Introduction

Invasive lungenaspergillose ist eine große Bedrohung für immungeschwächte Patienten, da die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt sind und erst bei einer frühen Diagnose erfolgreich sind, was zu hohen Sterblichkeitsraten führt1. Infektionserreger sind Conidia (Sporen) der Form Aspergillus fumigatus, die in den meisten Lebensräumen allgegenwärtig sind2. Conidia werden eingeatmet, passieren die Atemwege und können schließlich in die Lungenalveolen gelangen. Bei immunkompetenten Menschen werden diese Conidien durch angeborene Immunzellen wie Monozyten oder Makrophagen und neutrophile Granulozyten, die die Erreger aufnehmen (Phagozytose) aufnehmen und verdauen, gelöscht3. Phagozytose ist wichtig für Mikrobiologen und Immunologen, auch wenn sie an Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen interessiert ist. Konfrontationstests, wie die Ko-Inkubation von Leukozyten und Conidie, umfassen häufig die Kennzeichnung der Sporen durch Fluorescein oder deren Derivat Fluoresceinisothiocyanat (FITC). Mit Hilfe eines Mikroskops ist es einfach, verinnerlichte fluoreszierende Konidien zu identifizieren und angehängte/haftende Konidien zu bestimmen, obwohl dieser Ansatz umständlich und realistischerweise auf ein paar hundert Zellen beschränkt ist4. In der Durchflusszytometrie, die die Analyse von Hunderttausenden von Zellen innerhalb von Minuten leicht ermöglicht, ist jedoch eine differenzielle Färbung von phagozytosierter und anhaftender Konidie von entscheidender Bedeutung. Daher verlassen sich viele Protokolle auf Trypan Blue, um fitC-Fluoreszenz aus der anhaftenden Conidia5,6,7,8zu löschen. Ein anderer Ansatz ist die Nutzung der Fluoreszenzresonanzenergieübertragung von Ethidiumbromid und FITC, um rote statt grüne Fluoreszenz aus der anhaftenden Konidie9,10,11auszusenden. Wenn spezifische Antikörper verfügbar sind, wie dies bei einigen Bakterien der Fall ist, können zellgebundene Partikel direkt gebeizt werden12,13.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und quantitativen Bewertung der Phagozytose von FITC-markierter A. fumigatus conidia durch menschliche Leukozyten zusammen mit der Anhaftung von Sporen an Zellen und mangelnder Wechselwirkung durch den Einsatz eines Mitwirkungsmittels (APC)-gekoppelten Anti-FITC-Antikörpers. Die Methode ermöglicht auch die gleichzeitige zytometrische Analyse weiterer Zellmarker, die für die separate Analyse der Phagozytose durch Monozyten und Neutrophilen aus derselben Probe eingesetzt werden können.

Das Protokoll kann für die Charakterisierung von Pilzstämmen (z. B. mehrere Arten von Aspergillus und anderen Schimmelpilzen aus der Gattung Mucorales, die hier vorgestellt werden) und deren Mutanten14 und immunologische Forschung an Phagozyten, wie Leukozyten von immungeschwächten Individuen, angewendet werden.

Protocol

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichen Buffy-Mänteln, die vom Institut für Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Jena, und frischem venösem Blut von Patienten nach schriftlicher Zustimmung der Spender gemäß der Genehmigung der Ethikkommission 4357-03/15 erhalten wurden. 1. Zubereitung von Aspergillus fumigatus Conidia A. fumigatus auf 1,5% Malz-Agar-Petri-Schalen 5 Tage lang bei 37 °C ohne CO2anbauen.VORSICHT</s…

Representative Results

Bei der Messung der Phagozytose von A. fumigatus conidia durch menschliche phagozytische Zellen ist die Diskriminierung zwischen echter Internalisierung und bloßer Bindung von Conidia an die Zellen ein Hindernis, insbesondere wenn es um Hochdurchsatzmethoden wie Durchflusszytometrie geht. Um diese Hürde zu überwinden, präsentieren wir ein schnelles und zuverlässiges Protokoll, das auf der Färbung von Conidia mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC vor der Koinkubation von Zellen und Konidien basiert, gefolgt von…

Discussion

Dieses Protokoll stellt eine zytometrische Schnelle-Flow-Methode zur Messung der Wechselwirkung von A. fumigatus conidia mit einer großen Anzahl primärer menschlicher Leukozyten dar, was in gängigen mikroskopischen Protokollen nicht möglich ist. Die Bildgebung von Zellen mit einem Mikroskop und das manuelle Zählen von internalisierter Konidie ist umständlich und kann realistischerweise nur für ein paar hundert Zellen durchgeführt werden. Durchflusszytometrie überwindet dieses Problem, indem Tausende von…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Frau Pia Stier für die ausgezeichnete technische Unterstützung. M. von Lilienfeld-Toal wird vom Zentrum für Sepsis-Kontrolle und Pflege (Bundesministerium für Bildung und Gesundheit, BMBF, FKZ 01E01002) und dem InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D) unterstützt. Thi Ngoc Mai Hoang wird von der Jenaer Schule für Mikrobielle Kommunikation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2) unterstützt

Materials

Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

Riferimenti

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  2. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  3. Heinekamp, T., et al. Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).
  4. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  5. Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils. Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).
  6. Lowe, D. M., et al. A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils. Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).
  7. Nuutila, J., Lilius, E. M. Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells. Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).
  8. Saresella, M., et al. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes. Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).
  9. Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D’Amelio, R. New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis. Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).
  10. Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry. Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).
  11. Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).
  12. Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis. Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).
  13. de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells. Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).
  14. Hartung, S., et al. Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).
  15. Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry. Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).

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Citazione di questo articolo
Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

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