Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow
Summary
Este protocolo fornece um método rápido e confiável para medir quantitativamente a fagocitose de Aspergillus fumigatus conidia por phagocitos primários humanos usando citometria de fluxo e para discriminar a fagocitose da conidia de mera adesão a leukócitos.
Abstract
A infecção pulmonar invasora pelo molde Aspergillus fumigatus representa uma grande ameaça para os pacientes imunocomprometidos. Conidia fúngica inalada (esporos) são desmatadas dos avestélios pulmonares humanos por serem fagócitos por monócitos inatos e/ou neutrófilos. Este protocolo oferece uma medida rápida e confiável de fagocitose por citometria de fluxo usando conidia siciana tolice de fluoresceina (FITC) para co-incubação com leukócitos humanos e subsequente contramanchas com anticorpo antiFITC para permitir a discriminação de conidia internada e aderente celular. As principais vantagens deste protocolo são a sua rapidez, a possibilidade de combinar o ensaio com a análise citométrica de outros marcadores celulares de interesse, a análise simultânea de monócitos e neutrófilos de uma única amostra e sua aplicabilidade a outros fungos ou bactérias portadores de parede celular. A determinação de porcentagens de leukócitos de fagocitos fornece um meio aos microbiologistas para avaliar a virulência de um patógeno ou para comparar os wildtypes e os mutantes do micróbio patogénico assim como aos imunologistas para investigar capacidades humanas do leukocyte combater micróbios patogénicos.
Introduction
A aspergillose pulmonar invasiva é uma grande ameaça aos pacientes imunocomprometidos, pois as opções de tratamento são limitadas e só são bem-sucedidas após o diagnóstico precoce, o que leva a altas taxas de mortalidade1. Agentes infecciosos são conidia (esporos) do molde Aspergillus fumigatus que são onipresentes para a maioria dos habitats2. Conidia são inaladas, passam pelas vias aéreas e podem finalmente entrar no pulmão amasso. Em seres humanos imunocompetentes, estes conidia são limpos por células imunes inatas, como monócitos ou macrófagos e grânulos neutrófilos, que ocupam (fagocitose) e digerem os patógenos3. A fagocitose é importante para microbiologistas e imunologistas da mesma forma quando interessado em interações hospedóias-patógenos. Ensaios de confronto, como a co-incubação de leukócitos e conidia, muitas vezes incluem rotulagem dos esporos por fluoresceina ou sua fluoresceina derivada isotiaciana (FITC). Usando um microscópio, é simples identificar conidia fluorescente internalizada e determinar conidia anexada/aderente, embora essa abordagem seja complicada e realisticamente restrita a algumas centenas de células4. No entanto, na citometria de fluxo que facilmente permite a análise de centenas de milhares de células em poucos minutos, a coloração diferencial de conidia fagocitosada e aderente é vital. Portanto, muitos protocolos dependem trypan azul para saciar FITC-fluorescência de conidia adepto5,6,7,8. Outra abordagem é explorar a transferência de energia de ressonância fluorescência de brometo de etídio e FITC para emitir vermelho em vez de fluorescência verde da conidia aderente9,10,11. Se os anticorpos específicos estão disponíveis, como é o caso de algumas bactérias, partículas ligadas à célula podem ser diretamente manchadas12,13.
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar rápida e quantitativamente a fagocitose de FitC-rotulado A. fumigatus conidia por leukócitos humanos, juntamente com o apego de esporos às células e falta de interação, empregando uma alocecianina (APC) acoplado anticorpo anti-FITC. O método também permite a análise citométrica de fluxo simultâneo de marcadores celulares adicionais que podem ser empregados para análise separada da fagocitose por monócitos e neutrófilos da mesma amostra.
O protocolo pode ser aplicado para caracterização de cepas fúngicas (por exemplo, várias espécies de Aspergillus e outros moldes do gênero Mucorales apresentados aqui) e seus mutantes14 e pesquisa imunológica sobre fagócitos, como leukócitos de indivíduos imunocomprometidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta um método citométrico de fluxo rápido para medir a interação de A. fumigatus conidia com um grande número de leukócitos humanos primários que não são possíveis em protocolos microscópicos comuns. As células de imagem com um microscópio e conidia internalizada de contagem manual é complicada e podem ser feitas de forma realista apenas para algumas centenas de células. A citometria do fluxo supera este problema medindo milhares de pilhas dentro dos minutos. Um obstáculo co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Sra. Pia Stier por excelente assistência técnica. M. von Lilienfeld-Toal é apoiado pelo Center for Sepsis Control and Care (Ministério Federal Alemão de Educação e Saúde, BMBF, FKZ 01E01002) e InfectoGnóstics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang é apoiado pela Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
Riferimenti
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