Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's
Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo’s voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.
Abstract
De dynamiek van de ontwikkeling kan gevolgd worden door een confocale time-lapse microscopie van levende transgene zebravis embryo’s die fluorescentie uitdrukken in specifieke weefsels of cellen. Een probleem bij het opstellen van een hele embryo ontwikkeling is dat zebravis embryo’s aanzienlijk groeien. Bij montage zoals regelmatig gedaan bij 0,3-1% laag smelt agarose, legt de agarose groei beperking op, wat leidt tot verstoringen in het zachte embryo lichaam. Maar om confocale timelapse-microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis-embryo’s die de beweeglijkheid van de embryo’s beperken en tegelijkertijd de onbeperkte groei mogelijk maken. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties. Om te demonstreren de bruikbaarheid van deze methode, hele embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling werd afgebeeld in transgene vis voor 55 opeenvolgende uren. Deze montagemethode kan worden gebruikt voor eenvoudige, laaggeprijsde beeldvorming van hele zebravis embryo’s met omgekeerde microscopen zonder eisen van mallen of speciale apparatuur.
Introduction
De zebravis is al lang een modelorganisme voor ontwikkelingsbiologie, en microscopie is de belangrijkste methode om embryonale ontwikkeling te visualiseren. De voordelen van het gebruik van zebravis embryo’s voor ontwikkelingsstudies omvatten kleine afmetingen, optische helderheid, snelle ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid van de volwassen vis. De generatie van transgene zebravis lijnen die fluorescentie in bepaalde weefsels of cellen uitdrukken, heeft een directe visualisatie van weefsel ontwikkeling mogelijk op een manier die niet met grotere gewervelde dieren kan worden veroorzaakt. In combinatie met timelapse-microscopie kunnen Details en dynamiek van de weefsel ontwikkeling gemakkelijk worden bestudeerd.
Een probleem met de ontwikkeling van de zebravis is dat de embryo’s in de lengte aanzienlijk toenemen; het embryo breidt zijn lengte vier maal uit binnen de eerste 3 dagen van leven1. Ook is het lichaam van het vroege embryo zacht en wordt het gemakkelijk vervormd als de groei beperkt is. Maar om confocale microscopie uit te voeren, moet het embryo worden geïmmobiliseerd. Om embryo’s in een vaste positie te houden voor confocale timelapse-beeldvorming, worden ze regelmatig verdoiliseerd en gemonteerd in 0,3-1% laag smelt agarose. Dit heeft het voordeel dat er gedurende een bepaalde periode enige groei mogelijk is tijdens de beeldvorming, terwijl de bewegingen van het embryo worden beperkt. Delen van het embryo kunnen zo efficiënt als deze worden afgebeeld. Bij het gebruik van deze methode voor de beeldvorming van het hele embryo gedurende langere perioden worden echter verstoringen waargenomen vanwege de beperkte groei die door de agarose wordt veroorzaakt. Er zijn dus andere montage methodes nodig. Kaufmann en collega’s hebben een alternatieve montage van zebravis-embryo’s voor lichte blad microscopie beschreven, zoals selectieve vlak verlichtings microscopie (spim), door de embryo’s te monteren in buisjes met gefluoreerde ethyleen propyleen (FEP) die lage concentraties agarose of Hydroxypropyl methylcellulose2bevatten. Deze techniek produceert in de loop van de tijd een uitmuntende visualisatie van embryogenese. Schmid et al. Beschrijf de montage van maximaal zes embryo’s in agarose in VBO-buisjes voor lichte microscopie3 die verschillende embryo’s visualiseren in één beeldvormings sessie. Mallen zijn gebruikt om embryo arrays te maken voor een efficiënte montage van grotere aantallen embryo’s4. Masselkink et al. hebben 3D-gedrukte kunststof mallen gebouwd die kunnen worden gebruikt om silicium te maken dat zebravis-embryo’s in verschillende stadia kunnen worden geplaatst, waardoor montage in een constante positie voorbeeld vorming mogelijk wordt, inclusief confocale Imaging5. 3D-printen is ook gebruikt om mallen te maken voor een consistente positionering van zebravis embryo’s in 96-well format6. Sommige mallen zijn aangepast voor bepaalde stadia en kunnen geen onbeperkte groei voor lange perioden toestaan, terwijl andere mallen flexibeler zijn. Onlangs publiceerde Weijts et al. het ontwerp en de fabricage van een vier-waterput voor Live beeldvorming van zebravis embryo’s7. In dit gerecht worden de staart en romp van verdoven vissen embryo’s handmatig geplaatst onder een duidelijk silicone dak bevestigd net boven een afdekglas om een zak te vormen. Het embryo wordt vervolgens in deze positie vastgesteld door toevoeging van 0,4% agarose. Deze montage zorgt voor de beeldvorming van het ongeveer 2 mm lange posterieure deel (romp en staart) van het embryo, en aangezien tot 12 embryo’s per put kunnen worden gemonteerd, maakt de methode het mogelijk om meerdere monsters te maken. Op dezelfde manier presenteerden Hirsinger en Steventon onlangs een methode waarbij het hoofd van de vis wordt gemonteerd in agarose, terwijl de staart vrij kan groeien, en deze methode vergemakkelijkt ook de beeldvorming van het stam-en staart gebied van het embryo8.
Dit artikel beschrijft een gelaagde montagemethode voor zebravis embryo’s die de bewegingen van de embryo’s beperken en tegelijkertijd onbeperkte groei mogelijk maken. De voordelen van deze montagemethode zijn dat het een goedkope, snelle en eenvoudige methode is om embryo’s van verschillende stadia te monteren voorbeeld vorming met behulp van een omgekeerde Microscoop. De montage maakt lange-termijn beeldvorming van het hele lichaam (hoofd, romp en staart) tijdens de ontwikkeling van de embryo. Om de bruikbaarheid van deze methode te demonstreren, werd whole embryo vasculaire, neuronale en spierontwikkeling afgebeeld in transgene vis. Twee embryo’s per sessie, met twee golflengten in 3D, werden door time-lapse microscopie voor 55 opeenvolgende uren afgebeeld om films van weefsel ontwikkeling te renderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een montagemethode beschreven voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo’s. De meest kritieke stap voor de montagemethode is het bepalen van de optimale concentratie van agarose die de embryo groei met onbeperkte zebravis mogelijk maakt en tegelijkertijd de embryo’s in een volledig vaste positie voor confocale beeldvorming houdt. Omdat de optimale concentratie van agarose zeer smal is, is deze waarde zeer gevoelig voor de fouten in de meting van het gewicht van de agarose en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Albert pan en Arndt Sieakmann voor de geschenken van transgene vis. We danken Koichi Kawakami aan het National Institute of Genetics, het nationale Bioresource project van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan voor de gave van de transgene zebravis HGn39b. We bedanken ook Fatima Merchant en Kathleen Gajewski voor hulp bij confocale microscopie en Tracey Theriault voor foto’s.
Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Environmental Health Sciences van de National Institutes of Health (subsidie nummer P30ES023512 en contractnummer HHSN273201500010C). SU werd gesteund door een Fellowship van het Keck Computational Cancer biologie Program (Gulf Coast consortia CPRIT Grant RP140113) en Hugh Roy en Lillie Endowment Fund. J-Å G werd gesteund door de Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Riferimenti
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
