전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법
Summary
이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.
Abstract
발달의 역학은 특정 조직 또는 세포에 형광을 발현하는 살아있는 형질전환 제브라피시 배아의 공초점 시간 경과 현미경 검사법에 의해 뒤따를 수 있습니다. 화상 진찰 전체 배아 발달을 가진 어려움은 zebrafish 태아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다. 0.3-1% 낮은 용융 아가로스에서 정기적으로 장착할 때, 아가로세는 성장 제한을 가하여 부드러운 배아 체체의 왜곡을 초래합니다. 그러나 공초점 시간 경과 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 운동성을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 55시간 연속으로 형질전환 어류에서 영상화되었다. 이 장착 방법은 금형이나 특수 장비의 요구 사항없이 반전 된 현미경을 사용하여 전체 얼룩말 배아의 쉽고 저렴한 이미징에 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라피쉬는 오랫동안 발달 생물학의 모델 유기체였으며, 현미경 검사법은 배아 발달을 시각화하는 주요 방법입니다. 발달 연구를 위해 zebrafish 배아를 사용하는 장점은 작은 크기, 광학 선명도, 빠른 개발 및 성인 어류의 높은 배변성을 포함합니다. 특정 조직 또는 세포에서 형광을 발현하는 형질전환 제브라피시 라인의 생성은 더 큰 척추동물로는 불가능한 방법으로 조직 발달을 직접 시각화할 수 있게 하였다. 시간 경과 현미경 검사법과 함께, 조직 발달의 세부 사항 및 역학을 쉽게 연구 할 수 있습니다.
화상 진찰 zebrafish 발달을 가진 어려움은 배아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다; 태아는 수명1의첫번째 3 일 안에 그것의 길이를 4 시간 연장합니다. 또한, 초기 배아의 몸은 부드럽고 성장이 제한되면 쉽게 왜곡됩니다. 그러나 공초점 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 공초점 시간 경과 화상 진찰을 위한 고정된 위치에 배아를 지키기 위하여는, 그(것)들은 정규로 마취되고 0.3-1% 저용융 아가로즈에 거치됩니다. 이것은 태아의 운동을 제한하는 동안 특정 기간 동안 화상 진찰 도중 약간의 성장을 허용하는 이점이 있습니다. 배아의 부분은 이같이 능면화될 수 있습니다. 그러나, 장기간 동안 전체 배아의 화상 진찰을 위해 이 방법을 사용할 때, agarose에 기인한 제한된 성장 때문에 왜곡이 관찰됩니다. 따라서 다른 장착 방법이 필요합니다. Kaufmann 및 동료는 가로오스 또는 메틸셀룰로오스 2의 낮은 농도를 포함하는 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브에 배아를 장착함으로써 선택적 평면 조명 현미경 검사법 (SPIM)과 같은 가벼운시트 현미경 검사법에 대한 제브라피시 배아의 대체 장착을 설명했다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 배아 발생의 뛰어난 시각화를 생성합니다. Schmid 등은 1개의 화상 진찰 세션에서 몇몇 태아의 가시화를 제공하는 빛 시트 현미경 검사법3를 위한 FEB 관에 있는 아가로제에 있는 최대 6개의 배아의 설치를 기술합니다. 금형은 배아의 큰 숫자의 효율적인 장착을위한 배아 배열을 만드는 데 사용되었습니다4. Masselkink 등은 다양한 단계에서 제브라피시 배아를 배치할 수 있는 실리콘 주조를 만드는 데 사용할 수 있는 3D 프린팅 플라스틱 금형을 구성하여 공초점이미징을포함한 이미징을 위한 일정한 위치에 장착할 수 있습니다 5. 3D 프린팅은 또한 96웰 포맷6에서제브라피시 배아의 일관된 포지셔닝을 위한 금형을 만드는 데 사용되었습니다. 일부 금형은 특정 단계에 맞게 사용자 정의되며 장기간 무제한 성장을 허용하지 않을 수 있지만 다른 금형은 더 유연합니다. 최근, Weijts 등은 제브라피시 배아의 라이브 이미징을 위한 4웰 접시의 설계 및제작을7. 이 요리에서는 마취 된 물고기 배아의 꼬리와 줄기가 커버 유리 바로 위에 부착 된 투명한 실리콘 지붕 아래에 수동으로 배치되어 주머니를 형성합니다. 배아는 0.4% 아가로스를 첨가하여 이 위치에 고정된다. 이 장착은 배아의 약 2 mm 긴 후방 부분 (트렁크 및 꼬리)의 이미징을 허용하고, 최대 12 개의 배아가 잘 당 장착 될 수 있으므로, 방법은 여러 샘플의 이미징을 허용합니다. 마찬가지로, Hirsinger와 Steventon은 최근 꼬리가 자유롭게 자랄 수 있는 동안 물고기의 머리가 아가로오스에 장착되는 방법을 제시했으며,이 방법은 또한 배아8의트렁크 및 꼬리 부위의 이미징을 효율적으로 용이하게합니다.
이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 움직임을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 이 장착 방법의 장점은 모든 반전 된 현미경을 사용하여 이미징을위한 다양한 단계의 배아를 장착하는 저비용, 빠르고 쉬운 방법입니다. 장착은 배아 발달 도중 전신 (머리, 트렁크 및 꼬리)의 장기 적인 화상 진찰을 허용합니다. 이 방법의 유용성을 보여주기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 형질전환 어류에서 이미지화되었다. 세션당 2개의 배아, 3D의 2개의 파장에서 55시간 연속시간 경과 현미경검사법에 의해 이미지화되어 조직 발달의 영상을 렌더링하였습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전체 제브라피시 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 대한 장착 방법이 여기에 설명되어 있다. 장착 방법에 대한 가장 중요한 단계는 무제한 제브라피시 배아 성장을 허용하는 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 동시에 공초점 이미징을 위해 배아를 완전히 고정 된 위치에 유지하는 것입니다. 아가로즈의 최적 농도가 매우 좁기 때문에, 이 값은 용액을 제조하는 동안 아가로오스의 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 알버트 팬과 아른트 시에크만에게 형질전환 생선 선물을 주셔서 감사합니다. 일본 문화체육관광부의 국립생물자원사업인 국립유전학원의 가와카미 고이치(Koichi Kawakami)에게 형질전환 제브라피쉬 HGn39b의선물에 감사드립니다. 우리는 또한 공초점 현미경 검사법에 대한 도움을 파티마 상인과 캐슬린 Gajewski, 사진에 대한 트레이시 테리아울트에 감사드립니다.
이 작품은 국립 보건원의 국립 환경 보건 과학 연구소의 보조금에 의해 지원되었다 (보조금 번호 P30ES023512 및 계약 번호 HHSN2732015000010C). SU는 Keck 전산 암 생물학 프로그램 (걸프 코스트 컨소시엄 CPRIT 교부금 RP140113)과 휴 로이와 릴리 인다우먼트 기금의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. J-Å G는 로버트 A. 웰치 재단 (E-0004)에 의해 지원되었다.
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Riferimenti
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