Summary

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

Published: September 12, 2019
doi:

Summary

Descriviamo l’applicazione della nanospettroscopia a infrarossi e della microscopia a forza atomica ad alta risoluzione per visualizzare il processo di autoassemblaggio delle proteine in aggregati oligomerici e fibrille amiloidi, che è strettamente associato all’insorgenza e allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi neurodegenerativi umani.

Abstract

Il fenomeno del ripiegamento e dell’aggregazione delle proteine porta alla formazione di aggregati proteici altamente eterogenei, associati a condizioni neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. In particolare gli aggregati a basso peso molecolare, gli oligomeri amiloidi, hanno dimostrato di possedere proprietà citotossiche generiche e sono implicati come neurotossine in molte forme di demenza. Illustriamo l’uso di metodi basati sulla microscopia a forza atomica (AFM) per affrontare il difficile compito di caratterizzare le proprietà morfologiche, strutturali e chimiche di questi aggregati, che sono difficili da studiare utilizzando le strutturali convenzionali metodi biofisici sfusi a causa della loro eterogeneità e natura transitoria. Gli approcci di microscopia a sonda a scansione sono ora in grado di studiare la morfologia degli aggregati amiloidi con risoluzione sub-nanometrica. Dimostriamo qui che la nanospettroscopia a infrarossi (AFM-IR), che sfrutta contemporaneamente l’alta risoluzione dell’AFM e il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, può andare oltre e consentire la caratterizzazione delle proprietà strutturali dei singoli aggregati proteici, e quindi offrono approfondimenti sui meccanismi di aggregazione. Poiché l’approccio che descriviamo può essere applicato anche alle indagini sulle interazioni delle assemblee proteiche con piccole molecole e anticorpi, può fornire informazioni fondamentali per sviluppare nuovi composti terapeutici per diagnosticare o trattare disturbi neurodegenerativi.

Introduction

Oltre 40 milioni di persone in tutto il mondo sono attualmente colpite da disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer (AD)1 e le malattie di Parkinson (PD)2. Più in generale, più di cinquanta patologie sono associate a livello molecolare a misfolding e aggregazione delle proteine, un processo che porta alla proliferazione di aggregati di proteine fibrillari insolubili, noti come depositi di amiloide3, 4.Le origini molecolari della neurodegenerazione e i suoi legami con i cambiamenti conformazionali proteici delle proteine che portano alla formazione di amiloidi, tuttavia, rimangono poco chiare, in gran parte a causa dell’alto livello di eterogeneità, natura transitoria e su scala nanometrica dimensioni degli aggregati patologici4,5.

Indagini di grande successo sulle strutture proteiche negli ultimi decenni si sono basate ampiamente sull’uso di metodi sfusi, tra cui la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. All’interno di questa classe di tecniche, la spettroscopia a infrarossi (IR) è emersa come uno strumento analitico sensibile per svelare le proprietà chimiche dei sistemi biologici come le proteine8. I metodi di iR consentono la quantificazione delle variazioni strutturali secondarie e quaternarie durante il loro misfolding e aggregazione. Inoltre, al fine di decifrare ulteriormente a livello microscopico i dettagli meccanicistici coinvolti nei complessi paesaggi di energia libera delle proteine durante la loro aggregazione, un importante progresso è stato lo sviluppo di strumenti di cinetica chimica per estendere a complessi percorsi di auto-assemblaggio tra cui amiloide fibrille formazione5,6,7,10,11,12. Tuttavia, i metodi spettroscopici di massa forniscono solo informazioni medie sull’insieme eterogeneo di specie presenti nella soluzione o coinvolte in specifici passaggi microscopici, rendendo così lo studio delle proprietà biofisiche dei singoli specie aggregate impegnative al livello su nanoscala13,14.

Diverse tecniche di microscopia con la capacità di operare su scale più piccole del limite di diffrazione della luce sono emerse negli ultimi decenni. Questa classe di metodi include la microscopia elettronica (EM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) forniscono immagini bidimensionali (2D) di un campione, l’AFM è emersa negli ultimi decenni come una tecnica potente e versatile per studiare morfologie tridimensionali (3D), come così come le proprietà nanomeccaniche di un campione con risoluzione sub-nanometrica13,14,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa’ di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27.La logica alla base dello studio dell’aggregazione proteica tramite AFM è che questo approccio consente di studiare la morfologia delle singole specie presenti nella soluzione13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. In particolare, monitorando il campione in funzione del tempo, AFM consente di sforare l’evoluzione della morfologia della specie all’interno del campione, che permette di seguire e visualizzare i percorsi di formazione di amiloidi23, 25,38,39,40,41,42. Inoltre, AFM consente la quantificazione dei parametri strutturali come le altezze e le lunghezze trasversali delle singole specie presenti nella soluzione13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 (di sistema) , 45 anni , 46 per quanto , 47 o , 48. Tuttavia, lo studio di una singola proprietà biofisica, come la morfologia, spesso non è sufficiente quando si studiano sistemi biologici eterogenei e complessi. I metodi di imaging AFM, SEM o TEM da soli non rivelano facilmente le proprietà chimiche delle specie eterogenee di aggregati amiloidi su scala nanometrica.

Un importante progresso per l’analisi di campioni biologici eterogenei di questa portata è stato recentemente fatto con lo sviluppo e l’applicazione al campo dell’aggregazione proteica della nanospettroscopia infrarossa (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Questo metodo innovativo sfrutta la combinazione della risoluzione spaziale dell’AFM (1-10 nm) con il potere di analisi chimica di IR. La tecnica AFM-IR si basa sulla misurazione dell’effetto di risonanza indotta fototermica guidato da un laser AIR e sulla misurazione dell’espansione termica del campione in esame da parte della punta AFM. Il campione può essere illuminato dal laser a infrarossi direttamente dall’alto o dal basso nella riflessione interna totale, come nella spettroscopia a infrarossi convenzionale24,42,52,53 . Il laser a raggi IR può essere pulsato con frequenze tipiche nell’ordine di centinaia di kilohertz (1,1000 kHz) e sintonizzato su un’ampia gamma spettrale, in genere tra i 1000-3300 cm-1. Anche se la sorgente laser copre un’area di 30 m di diametro, la risoluzione spaziale della tecnica AFM-IR è determinata nominalmente dal diametro della punta AFM, che rileva l’espansione termica locale del sistema. AFM-IR è adatto per studiare campioni biologici perché il segnale IR è proporzionale al loro spessore fino a 1,5 m, e gli spettri IR risultanti sono generalmente in accordo con i corrispondenti spettri di trasmissione FTIR13,54 ,55. Per questo motivo, i metodi stabiliti di analisi in spettroscopia possono essere facilmente applicati, come lo studio dei cambiamenti chimici, il cambiamento della forma della banda e la de-convoluzione mediante l’analisi dei secondi derivati52. Nel complesso, combinando la risoluzione spaziale dell’AFM con il potere di riconoscimento chimico della spettroscopia IR, AFM-IR consente l’acquisizione simultanea di un’ampia gamma di proprietà morfologiche, meccaniche e chimiche di un campione su scala nanometrica.

Qui, illustriamo un protocollo per la caratterizzazione del processo di aggregazione proteica che sfrutta la combinazione di saggi di fluorescenza in vitro, imaging AFM ad alta risoluzione e AFM-IR su nanometrica. Questo approccio combinato ha già eccellere nel fornire risultati dettagliati nello studio delle proprietà chimiche e strutturali delle singole micro-goccioline formate da aggregati proteici, nello studio della separazione di fase delle proteine liquide liquide e in studiare l’eterogeneità e le proprietà biofisiche delle singole specie aggregate su nanoscala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. Saggi di aggregazione sui lettori di placche a fluorescenza NOTA: Il protocollo qui descritto è un esempio di come studiare l’aggregazione di qualsiasi proteina o peptide da cinetica chimica. In particolare, descrive un protocollo ottimizzato per studiare l’aggregazione del peptide A42, che è coinvolto nell’insorgenza e nella progressione del morbo di Alzheimer58,59. Un protocollo simile può essere regolato e adottato per studiare …

Representative Results

Nella figura 1 è illustrato un corso di tempo rappresentativo di aggregazione a 42, misurato dal saggio di fluorescenza ThT, nella Figura 1. Il processo di aggregazione è comunemente caratterizzato da una curva sigmoidale, in cui si osserva inizialmente una fase di ritardo, ed è seguito da una fase di crescita ripida, prima che la curva raggiunga un altopiano quando viene raggiunto uno stato stabile di equilibrio6,7 , <…

Discussion

Il primo passo critico di questo protocollo è la preparazione di proteine monomeriche, come nel caso della soluzione A42 descritta nei passaggi 1.1 e 1.2. È essenziale avviare il processo di aggregazione da una soluzione monomerica altamente pura, in quanto la presenza di specie oligomeriche o aggregate può provocare una scarsa riproducibilità della cinetica di aggregazione58e indurre artefatti nell’AFM misurazioni (ad esempio, le specie di fibrillar saranno evidenti nelle fasi iniziali dell’a…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza (SNF) per il sostegno finanziario (numero di sovvenzione P2ELP2_162116 e P300P2_171219), il programma Darwin College, Erasmus la ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell’ambito del settimo programma quadro dell’Unione europea (FP7/2007-2013) attraverso la sovvenzione del CER PhysProt (numero di accordo 337969), la Newman Foundation (T.P.J.K.) e la Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. e T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

Riferimenti

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926 (2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie – International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541 (2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V., Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. , 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101 (2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie – International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie – International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225 (2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9 (2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C., Braga, P. C., Ricci, D. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. 736, 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903 (2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B., Frewin, C. L. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology – From Cell to Protein. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. . Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).

View Video