적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

전 세계적으로 4천만 명 이상이 현재 알츠하이머(AD)^1및 파킨슨병(PD)^2질환과 같은 신경퇴행성 질환의 영향을 받고 있습니다. 더 일반적으로, 50개 이상의 병리학은 단백질 오측 및 응집과 분자 수준에서 연관되며, 아밀로이드 침전물로 알려진 불용성 섬유소 단백질 응집체의 증식을 유도하는^{과정3, 4}. 신경 변성의 분자 기원과 아밀로이드 형성으로 이어지는 단백질의 단백질 형태 변화와의 연관성은 이질성, 일시적 성질 및 나노 스케일의 높은 수준 때문에 많은 부분에서 불분명하게 남아 있습니다. 병리학 적 응집체 의 크기^4,5.

지난 수십 년 동안 단백질 구조에 대한 매우 성공적인 조사는 X 선 결정학, 극저온 전자 현미경 및 핵 자기 공명 분광법을 포함한 벌크 방법의 사용에 널리 기반을 두고 있습니다^{5, 6개 , 7명 , 8개 , 9}. 이러한 종류의 기술 내에서 적외선 (IR) 분광법은 단백질^8과같은 생물학적 시스템의 화학적 특성을 해명하는 민감한 분석 도구로 부상했습니다. IR 방법은 잘못 접고 응집하는 동안 단백질 이차 및 사분의 구조적 변화의 정량화를 허용합니다. 또한, 미세한 수준에서 더 해독하기 위해 그들의 응집 동안 단백질의 복잡한 자유 에너지 풍경에 관여하는 기계적 세부 사항은, 복잡한 으로 확장하는 화학 역학 도구의 개발이 주요 진전되었습니다. 아밀로이드 섬유형성^{5,6,7,10,11,12를}포함한 자가 조립 경로. 그러나 대량 분광 방법은 용액에 존재하거나 특정 현미경 단계에 관여하는 종의 이기종 앙상블에 대한 평균 정보만 제공하므로 개인의 생물 물리학적 특성에 대한 조사가 가능합니다. 나노 규모 수준에서 도전 집계 종^13,14.

빛의 회절 한계보다 작은 저울에서 작동 할 수있는 능력을 가진 여러 현미경 기술이 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 방법의 이 부류는 전자 현미경 검사법 (EM) 및 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 포함합니다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)은 표본의 2 차원 (2D) 심상을 제공하는 동안, AFM은 3 차원 (3D) 형태를 연구하는 강력하고 다양한 기술로 지난 수십 년 동안 등장했습니다. 뿐만 아니라 하위 나노 미터 해상도^{13,14,15,16,17,18,19와}샘플의 나노 기계적^{특성으로, 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27}. AFM을 통한 단백질 응집을 연구하는 근거는 이 접근법이 용액^13,14,16에존재하는 개별 종의 형태를 조사할 수 있다는 것입니다. ^17,19,20,21,25 ,^{27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. 특히, 시료를 시간의 함수로 모니터링함으로써, AFM은 시료 내 종의 형태학적 진화에 대한 조사를 가능하게 하며, 이는 아밀로이드^{형성(23)의}경로를 따르고 시각화할 수 있게^{한다. 25,38,39,40,41,42}. 또한 AFM은 용액^{13,19,30,31에 존재하는 개별 종의 단면 높이 및 길이와 같은 구조적 파라미터의 정량화를 가능하게 합니다. ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44세 , 45세 , 46세 , 47세 , 48}. 그러나 형태학과 같은 단일 생물 물리학적 특성에 대한 연구는 종종 이기종적이고 복잡한 생물학적 체계를 연구할 때 충분하지 않다. AFM, SEM 또는 TEM 이미징 방법만으로는 나노 스케일에서 아밀로이드 응집체의 이질적인 종의 화학적 특성을 쉽게 드러내지 않습니다.

이 규모의 이질성 생물학적 시료의 분석을 위한 주요 진전은 최근 적외선 나노스펙트로스프로그(AFM-IR)^{24,26, 24, 26의}단백질 응집 분야에 대한 개발 및 적용으로 이루어졌습니다. ^{38,42,49,50,51,52}. 이 혁신적인 방법은 AFM(~1−10 nm)의 공간 분해능과 IR의 화학적 분석 능력을 결합합니다. AFM-IR 기술은 IR 레이저에 의해 구동되는 광열 유도 공진 효과의 측정및 AFM 팁에 의한 조사 중인 시료의 열 팽창 측정을 기반으로 합니다. 샘플은 기존의 적외선 분광법^{24,42,52,53과 마찬가지로 총 내부 반사에서 상부 또는 아래에서 직접 IR 레이저에 의해 조명 될 수 있습니다.} . IR 레이저는 수백 킬로헤르츠(1-1000 kHz)의 순서로 일반적인 주파수로 펄스할 수 있으며 일반적으로 1000-3300^cm-1사이의 넓은 스펙트럼 범위에서 튜닝될 수 있습니다. 레이저 소스가 ~ 30 μm 직경의 영역을 커버하지만, AFM-IR 기술의 공간 해상도는 시스템의 국부적 열 팽창을 감지하는 AFM 팁 직경에 의해 명목상으로 결정됩니다. AFM-IR은 IR 신호가 최대 1-1.5 μm의 두께에 비례하기 때문에 생물학적 샘플을 연구하는 데 적합하며, 생성된 IR 스펙트럼은 일반적으로 해당 FTIR 전송 스펙트럼^{13,54와 일치합니다. ,55}. 이러한 이유로, 분광학에서 확립된 분석 방법은 제2 유도체^분석에의한 화학적 변화, 대역 형상 변화 및 탈컨볼에 대한 연구와 같은 용이하게 적용될 수 있다. 전반적으로 AFM의 공간 분해능과 IR 분광법의 화학적 인식 력을 결합한 AFM-IR은 나노 스케일에서 시료의 다양한 형태학적, 기계적 및 화학적 특성을 동시에 수집할 수 있게 합니다.

여기서, 우리는 시험관 내 형광 분석법, 고해상도 AFM 이미징 및 나노 스케일 AFM-IR의 조합을 이용하는 단백질 응집 과정의 특성화를 위한 프로토콜을 설명한다. 이 결합된 접근법은 이미 단백질 응집체에 의해 형성된 개별 미세 방울의 화학적 및 구조적 특성을 연구하고, 액체-액체 단백질 상 분리에 대한 연구에서 상세한 결과를 제공하는 데 탁월했습니다. 나노 규모^23,26,38,^{45,50,53에서}개별 집계 종의 이질성 및 생물 물리학적 특성을 조사 ^56,57.