여기에서 우리는 수유 행동 도중 이 근육의 역할을 이해하기 위하여 해양 연체 동물 Aplysia californica의 공급 장치에 내재된 근육의 최소침습 외과 병변을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Aplysia californica는 학습과 행동의 신경 제어를 연구하기위한 모델 시스템입니다. 이 동물은 반 개방 순환 시스템을 가지고 있어 큰 손상을 입지 않고 많은 내부 구조물에 접근할 수 있습니다. 많은 조작은 생체 외와 시험관 내에서 쉽게 수행 될 수 있으므로 행동 및 신경 회로 분석을위한 고도로 견인 가능한 모델입니다. 수유 그리퍼 내의 근육의 기능을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 동물의 본체 구멍을 열거나 수유 기관의 외부 층 (즉, 볼 질량)을 손상시키지 않고 병변을하는 기술을 개발했습니다. 이 기술에서는, grasper는 부분적으로 에버로 되어 있어 근육에 직접 접근할 수 있습니다. 이 절차를 통해 동물은 빠르고 안정적으로 회복할 수 있습니다. 이것은 I7 근육과 아방산이 있는 섬유를 병변으로 만들었기 때문에 두 근육이 생체 내 개구부에 크게 기여한다는 것을 보여줄 수 있습니다.
Aplysia californica의 공급 시스템은 학습 및 기억 1, 동기 부여행동2,3,및 행동, 생체 역학 및 사이의 상호 작용을 이해하는 모델 시스템으로 사용의 오랜 역사를 가지고 먹이 동안 신경 제어4. 그것은 매우 접근 신경 회로, 큰의 상대적으로 적은 수와, 식별 가능한 뉴런. 동물은 반 개방 순환 시스템을 가지고 있어 상당한 손상을 일으키지 않고 많은 내부 구조물에 접근할 수 있습니다. 그것은 또한 생체 외와 생체 외에서 많은 조작에 강력한, 행동 및 신경 회로의 분석을 위한 높은 견인 모델 만들기.
먹이 행동을 초래하는 신경 패턴을 이해하려면 수유 기관인 볼질량 4를 구성하는 연약한 구조의 근본적인 역학을설명하는 것이 중요합니다. 5,6,배구체의 표면을 제어하는 볼 질량 내의 기본 구조의 내부 근육을 구성하는 외부 근육을 특성화하는 작업이 수행되었지만, 오돈토포레는 생체 내 실험에 크게 접근할 수 없습니다. 이러한근육의일부에 대 한 생체 외에서 연구 되었습니다 7,8,이러한 근육에 직접 액세스의 부족 어렵게 그들의 역할을 공부 하기 어렵게 만든, 행동 동물.
Aplysia 또는 유사한 연체 판 종에서 전극 이식 또는 병변에 대한 대부분의 기술은 신체 벽을열것을 요구 9,10,11,12. 신체 벽을 열면 상피 손상이 발생하며 절개는 hemolymph 탈출을 방지하기 위해 단단히 밀봉되어야합니다. 더 심각한 어려움은 Aplysia의 grasper의 grasper의 내부 근육에 도달 하려고 할 때 제기 (방사 표면 또는 odontophore 내에서 근육): 본체 구멍을 통해 입력 하는 데, 하나는 다음 몇 가지 를 통해 이동 해야 합니다. 내부 구조에 대한 액세스를 얻기 위해 볼 질량의 근육벽의 부분 (그림 1A). 이러한 누적된 부상 및 접근의 어려움은 동물이 이러한 수술에서 잘 회복되지 않기 때문에 기존의 수단을 통해 접근하게 되었다 (전체 회귀와 동물의, 단지 17%는 어떤 공급 능력을 회복, N = 12. 약 85%의 비적원 동물이 사료능력을 되찾았고, N =84).
방사체 오프너 8로 특징 지어진 I7근육은 오돈토포어 내부 깊숙이 있어 접근성이 더욱 복잡해졌습니다. 그것은 방사줄기의 기저부(도1C)와 방사체 표면의 밑면 사이에 뻗어, 오돈토포레의 내강을 통해(그림1C). I7 근육의 세 면에는 근육벽이 있고 네 번째 벽은 방사형 줄기로 구성됩니다. 생체 역학 연구의 목적을 위해, 이러한 구조중 어느 것에도 큰 손상을 주면 공급 장치의 정상적인 기능이 손상될 수 있습니다. 우리는 턱을 통해 오돈토포레를 밖으로 작동하고 얇은 연골 반경 표면에 절개를 통해 수술을 실시하는 새로운 접근법을 개발하여 I7 근육을 병변할 수 있게 했으며, 새로 기술된 미세 근육 섬유를 개발했습니다. 우리가 하위 방공 섬유로 참조 하는 방현면 아래 실행 (그림1C).
그림 1: 해부학 개요. (A) 아클리시아 내의 볼 질량의 위치. (B) 안부포어의 외부 해부학. 라둘라와 방공낭의 표면은 노란색입니다. 오돈토포어를 구성하는 근육은 실제 색상에 따라 빨간색으로 표시됩니다. (C) 오돈토포어의 시상 섹션으로, 경반섬유(곡선형 분홍색 선)와 I7 근육(직선 분홍색 선)의 위치를 보여준다. I6 근육의 단면은 진한 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하고, 볼 질량의 감전이 기본 근육에 액세스하기에 충분하다는 것입니다. 이러한 단계를 완료하기 위해 몇 가지 연습이 필요할 수 있지만 일단 마스터되면 수술의 수율이 수행 된 모든 실험의 85 % 이상이 될 수 있습니다. 프로토콜을 올바르게 수정하고 문제를 해결하는 가장 중요한 방법은 내부 근육의 위치가 조사자에게 완전히 명확하도록 볼 질량의 해부를 수행하는 데 시간을 할애하는 것입니다. 방사체 표면을 통한 제안된 절개는 필연적으로 근본적인 아방광 섬유에 약간의 손상을 야기하기 때문에, 이러한 섬유의 특정 영역을 피하기 위해 절개의 정확한 위치를 수정하는 것이 적절할 수 있다.
외과 기술의 한 가지 제한은 양성강도와 같은 공급 반응에 비특이적 인 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하는 한 가지 방법은 동물이 자신의 통제 역할을 하도록 하는 것입니다. 또한, 특정 근육(즉, I7 또는 SRF)의 제거를 제외하고 전체 수술 프로토콜을 실시하는 가짜 병변 기를 가지는 것이 중요하다. 이러한 제안에 따라, 조사원은 동물 사이의 가변성의 효과를 감소시키고 수술의 비 특정 효과의 본질적인 측정을해야합니다.
이전 작업은 병변에 신체 벽을 통해 접근 방식을 사용하거나 신경에서 중 하나를 기록13,14,또는 근육15,16,17. 우리의 실험실에서, 우리는 일화적으로 신체 벽 절개는 종종 hemolymph의 상당한 손실과 따라서 신체 볼륨의 동반 것을 관찰했다. 동물은 종종이에서 복구하는 데 며칠이 필요하며, 신체 벽 병변이 조심스럽게 봉합되지 않으면 동물이 회복되지 않을 수 있습니다. 또한, 동물의 사후 검사는 절개 및 강한 면역 반응 (일화 관찰)의 주위에 상당한 흉터를 보여줍니다. 대조적으로, 동물은 여기에 기술된 프로토콜로부터 회복 된 후 혈림프 또는 체적 의 변화의 손실을 보여주지 않는다 (96 동물의 관찰에 기초).
기술의 미래 응용은 Aplysia의 공급 장치 내의 다른 근육으로 확장 할 수 있습니다, 및 다른 동물. 우리는 I7 근육과 아방산이 섬유의 제거에 초점을 맞추고있다. 이 같은 일반적인 외과 기술은 또한 odontophore의 그밖 근육의 대부분에 접근을 허용합니다. 이들 중 일부는, I5 근육의 내부 부분 등, 가장 방공 표면을 통해 액세스. 다른 사람, I4의 내부 전단지 처럼, 더 나은 odontophore의 외부 상피를 통해 도달 될 수 있습니다. 우리는 부분적으로 에버로된 오돈토포어의 방진 갈라진 부분 아래 절개가 삽입될 수 있는 날카로운 후크에 대한 접근을 허용한 예비 시험을 치렀으며, 이는 오돈토포어 내의 다른 근육을 병변으로 사용할 수 있는, 근육 I88. 여기에 설명된 수술 프로토콜은 본체 구멍을 열지 않기 때문에 봉합이 필요하지 않습니다.
우리가 기술한 프로토콜은 그렇지 않으면 조작하기 어려운 연약한 조직 구조물에 일하는 그밖 조사자에게 일반적인 관심사일지도 모릅니다, 예를 들면, 그밖 연체 동물의 공급 장치. 더 일반적으로, 이 프로토콜은 혀, 트렁크 또는 촉수18과같은 연약한 구조물의 분석에 그밖 새로운 외과 접근을 건의할 수 있었습니다.
The authors have nothing to disclose.
셰리 니겔, 시루, 조이 우가 이러한 프로토콜을 개선하고 검증하기 위해 노력한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 NSF 그랜트 IOS 1754869에 의해 지원되었다.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |