DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling
Summary
Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.
Abstract
DNA-Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die die DNA-Synthese von Okazaki-Fragmenten auf dem laggierenden Strang durch DNA-Polymerase während der DNA-Replikation initiieren. Die Bindung von prokaryotischen DnaG-ähnlichen Primasen an die DNA erfolgt in einer bestimmten Trinukleotid-Erkennungssequenz. Es ist ein entscheidender Schritt bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten. Herkömmliche biochemische Werkzeuge, die zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz von DNA-Primase verwendet werden, liefern nur begrenzte Informationen. Anhand eines mikroarraybasierten Bindungstests mit hohem Durchsatz und aufeinander folgenden biochemischen Analysen wurde gezeigt, dass 1) der spezifische Bindungskontext (flankierende Sequenzen der Erkennungsstelle) die Bindungsfestigkeit der DNA-Primase an ihre Schablone beeinflusst. DNA und 2) eine stärkere Bindung von Primase an die DNA ergibt längere RNA-Primer, was auf eine höhere Prozessivität des Enzyms hindeutet. Diese Methode kombiniert PBM und Primase Aktivität Assay und wird als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet, und es ermöglicht die Charakterisierung der spezifischen Sequenzerkennung durch DNA-Primase in beispielloser Zeit und Skalierbarkeit.
Introduction
HTPP nutzt die DNA-bindende Mikroarray-Technologie in Kombination mit biochemischer Analyse (Abbildung 1), um spezifische Merkmale von DNA-Vorlagen, die die enzymatische Aktivität von DNA-Primase beeinflussen, statistisch zu identifizieren. Daher bietet HTPP eine technologische Plattform, die einen Wissenssprung auf diesem Gebiet erleichtert. Die klassischen Werkzeuge, die verwendet werden, um Primase-Erkennungs-Sites zu bestimmen, haben nicht die Fähigkeit, eine riesige Datenmenge zu liefern, während HTPP dies tut.
PBM ist eine Technik, die routinemäßig verwendet wird, um die Bindungspräferenzen von Transkriptionsfaktoren an DNA1,2zu bestimmen; es ist jedoch nicht geeignet, eine schwache/transiente Bindung von Proteinen an die DNA zu erkennen. Im Gegensatz zum universellen PBM, das Informationen über die durchschnittliche Proteinbindungsspezifität zu allen möglichen Sequenzen aus acht Basenpaaren liefert, basiert HTPP auf der Bibliothek einsträngiger DNA-Vorlagen, die einzigartige Sequenzelemente enthalten. Solche DNA-Sequenzelemente umfassen Zehntausende kurze (wenige Dutzend bp) genomische Sequenzen sowie computerisch gestaltete DNA-Sequenzen, die in bestimmten DNA-Wiederholungssequenzelementen angereichert sind, die im Genom vorhanden sind und unterschiedliche durchschnittliche GC-Gehalte aufweisen. . Ein solcher Ansatz mit hohem Durchsatz ermöglicht die systematische, quantitative und hypothesengesteuerte Bestimmung der sequenzbezogenen Eigenschaften, die für die Primasebindung und ihre enzymatische Aktivität wichtig sind3. Insbesondere wurde für dieses enzymatische Systemdiewichtige Verbindung zwischen Primase-DNA-Bindungspräferenzen (moduliert durch DNA-Sequenzen, die bestimmte Trinukleotid-Bindungsstellen flankieren) und der Primase-Prozessivität identifiziert 4 .
Die neue Technologie wurde angewendet, um unser Verständnis von Primase-Erkennungsstellen auch für die T7 DNA Primase zu überprüfen, die ausgiebig untersucht wurde5. Insbesondere die erneute Untersuchung klassischer Konzepte, wie DNA-Erkennungsstellen von T7-DNA-Primase (die vor fast vier Jahrzehnten bestimmt wurden 6) mit Protein-DNA-bindendem Mikroarray (PBM) hat zu beispiellosen Erkenntnissen in Merkmalen geführt, die mit die flankierende Reihenfolge dieser Erkennungsstellen3. Es wurde erwartet, dass die Sequenzen, die die Trinukleotid-Erkennungsstelle von T7 DNA Primase (5′-GTC-3′) flankieren, zufällig sein werden. Stattdessen fanden wir heraus, dass TG-reiche Flankensequenzen die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass T7-DNA-Primse längere RNA-Primer synthetisieren, was auf eine Erhöhung der Prozessivität hindeutet.
Andere Methoden, die verwendet werden können, um DNA-bindende Eigenschaften von Proteinen in vitro zu untersuchen, sind der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstest (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)9und Southwestern Blotting 10. Dabei handelt es sich jedoch um Methoden mit geringem Durchsatz, die nur zur Untersuchung einer kleinen Anzahl von DNA-Sequenzen gelten. Darüber hinaus ist die Genauigkeit und Empfindlichkeit einiger dieser Techniken (z. B. EMSA) gering. Andererseits ist die In-vitro-Auswahl11 eine Technik, die ähnlich wie PBM zur Identifizierung zahlreicher Bindungssequenzen eingesetzt werden kann. Jedoch, niedrige Affinität Sequenzen sind in der Regel in den meisten Anwendungen der In-vitro-Auswahl ausgeschlossen; Daher ist dieser Ansatz nicht geeignet, vergleichende Verbindliche Daten für alle verfügbaren Sequenzen zu erhalten. Das universelle PBM1,2 wird hauptsächlich verwendet, um die Bindungsspezifitäten von Transkriptionsfaktoren von Prokaryoten und Eukaryoten sowie spezifische Faktoren (z. B. Vorhandensein bestimmter Liganden, Kofaktoren usw.) zu charakterisieren, die diese Interaktion beeinflussen12.
HTPP erweitert die PBM-Anwendung auf DNA-verarbeitungsenzyme, indem beispiellose statistische Leistung mit hohem Durchsatz mit hoher Präzision kombiniert wird, um Informationen über den Bindungssequenzkontext bereitzustellen. Solche Daten wurden für Primas und verwandte Enzyme (die eine schwache/transiente Bindung an die DNA haben) aufgrund der oben genannten technischen Beschränkungen anderer verfügbarer Techniken noch nicht gewonnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die PBM-Methode wurde weit verbreitet, um bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und kann auch auf DNA-Verarbeitungsenzyme wie DNA-Primase angewendet werden, die an DNA mit geringer Affinität binden. Es sind jedoch bestimmte Änderungen der Versuchsverfahren erforderlich. Das Mikroarray-Experiment umfasst mehrere Schritte: Entwurf der DNA-Bibliothek, Vorbereitung des Chips, Bindung des Proteinziels, fluoreszierende Kennzeichnung und Scannen. Milde Waschschritte sind entscheidend, da die langen W…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Zuschuss Nr. 1023/18) unterstützt.
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
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| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Riferimenti
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- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
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