Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase
Summary
Эксперименты по связыванию белков (PBM) в сочетании с биохимическими анализами связывают связывающие и каталитические свойства примаза ДНК, фермента, который синтезирует РНК-праймеры на шаблоне ДНК. Этот метод, обозначенный как высокопроизводительный профилирование примаза (HTPP), может быть использован для выявления ДНК-связывающих моделей различных ферментов.
Abstract
Прима засовка ДНК синтезирует короткие РНК-праймеры, которые инициируют синтез фрагментов ДНК фрагментов Окадзаки на отстающей нити путем полимераза ДНК во время репликации ДНК. Привязка прокариотических примаз, похожих на днк, происходит в определенной последовательности распознавания тринуклеотидов. Это ключевой шаг в формировании фрагментов Окадзаки. Обычные биохимические инструменты, которые используются для определения последовательности распознавания ДНК примаза ДНК, предоставляют лишь ограниченную информацию. Использование высокой пропускной способности микроаррей на основе связывания анализа и последовательных биохимических анализов, было показано, что 1) конкретный обязательный контекст (фланговые последовательности сайта распознавания) влияет на силу прима ДНК к его шаблону ДНК, и 2) сильнее связывания примаза к ДНК дает больше РНК праймеров, что свидетельствует о более высокой processivity фермента. Этот метод сочетает в себе PBM и primase деятельности анализа и обозначен как высокой пропускной способности примаза профилирования (HTPP), и это позволяет характеристика конкретной последовательности распознавания примаза ДНК в беспрецедентное время и масштабируемости.
Introduction
HTPP использует технологию связывания МИКРОаррей ДНК в сочетании с биохимическим анализом(рисунок 1) для статистическиго определения специфических особенностей шаблонов ДНК, влияющих на ферментативную активность примазы ДНК. Таким образом, HTPP обеспечивает технологическую платформу, которая облегчает скачок знаний в этой области. Классические инструменты, используемые для определения сайтов распознавания приносов, не имеют возможности давать огромное количество данных, в то время как HTPP делает.
PBM метод, обычно используемый для определения обязательных предпочтений транскрипционных факторов к ДНК1,2; однако, он не подходит для обнаружения слабого/переходного связывания белков к ДНК. В отличие от универсального PBM, который предоставляет информацию о средней специфичности связывания белка ко всем возможным последовательностям, состоящим из восьми базовых пар, HTPP основан на библиотеке одноцепочечных шаблонов ДНК, включающих уникальные элементы последовательности. Такие элементы последовательности ДНК включают десятки тысяч коротких (несколько десятков вт) геномных последовательностей, а также вычислительно разработанные последовательности ДНК, обогащенные определенными репетитными элементами последовательности ДНК, присутствующими в геноме, которые обладают разным средним содержанием GC . Такой высокопроизводительный подход позволяет определить, в систематическом, количественных и гипотезы инициативе образом, последовательности, связанные свойства, которые важны для примкассвязи и его ферментативной деятельности3. В частности, для этой ферментативной системы4была определена важная связь между примазно-ДНК связывающими предпочтениями (модулированными последовательностями ДНК, обрамляющими конкретные тринуклеотидные связывающие участки) и процессивой примазы.
Новая технология была применена, чтобы вернуться к нашему пониманию сайтов признания примаза даже для прима T7 ДНК, которая была широко изучена5. В частности, пересмотр классических концепций, таких как сайты распознавания ДНК примаза T7 DNA (которые были определены почти четыре десятилетия назад 6)с использованием белково-ДНК связывающего микроаррей (PBM) привело к беспрецедентному пониманию особенностей, связанных с фланговой последовательности этих сайтов распознавания3. Ожидалось, что последовательности фланговых трехнуклеотидных признания сайта прима задневок T7 (5′-GTC-3′) будут случайными. Вместо этого, мы обнаружили, что TG богатых фланговых последовательностей увеличить шансы T7 ДНК прима синтезировать больше РНК праймеров, указывающих на увеличение процессоцивистии.
Другие методы, которые могут быть использованы для изучения ДНК-связывающих свойств белков in vitro включают электрофоретический перекос анализа (EMSA)7, DNase Iслед8, поверхностно-плазмон резонанс (SPR)9, и юго-западной blotting 10. Это, однако, методы низкой пропускной необходимости применимы только к исследованию небольшого числа последовательностей ДНК. Кроме того, точность и чувствительность некоторых из этих методов (например, EMSA) является низкой. С другой стороны, in vitro selection11 является методом, который, подобно PBM, может быть использован для идентификации многочисленных связывающих последовательностей. Тем не менее, низкие последовательности сродства, как правило, исключены в большинстве приложений в пробирке выбор; поэтому этот подход не подходит для получения сравнительных обязательных данных по всем имеющимся последовательностям. Универсальный PBM1,2 в основном используется для характеристики связывающей специфики транскрипционных факторов от прокариот и эукариот, а также специфические факторы (например, наличие определенных лигандов, кофакторов и т.д.), которые могут повлиять на это взаимодействие12.
HTPP расширяет применение PBM для ферментов обработки ДНК, сочетая беспрецедентную высокопроизводительную статистическую мощность с высокой точностью, чтобы предоставить информацию о контексте связывающей последовательности. Такие данные еще не получены по примазам и связанным с ними ферментам (которые имеют слабую/переходную связующую к ДНК) из-за вышеупомянутых технических ограничений других доступных методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод PBM широко используется для исследования связывающих свойств транскрипционных факторов, а также может быть применен к ферментам обработки ДНК, таким как прима закваска ДНК, которые связываются с ДНК с низким сродством. Однако необходимы определенные изменения экспериментальных ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (грант No 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Riferimenti
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
