Summary

Descubrimiento de producto natural con filtrado de fragmentación de diagnóstico LC-MS/MS: aplicación para análisis de Microcystin

Published: May 31, 2019
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Summary

El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.

Abstract

Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares, en lugar de un solo compuesto. Debido a sus características estructurales comunes, muchos compuestos dentro de la misma clase se someten a una fragmentación MS/MS similar y tienen varios iones de producto idénticos y/o pérdidas neutrales. El propósito del filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF) es detectar eficientemente todos los compuestos de una clase dada en un extracto complejo mediante el cribado de datasets LC-MS/MS no dirigidos para espectros MS/MS que contengan iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales. Este método se basa en un módulo DFF implementado dentro de la plataforma MZmine de código abierto que requiere que los extractos de muestra sean analizados mediante la adquisición dependiente de los datos en un espectrómetro de masas de alta resolución, como Orbitrap cuadrupolo o masa de tiempo de vuelo cuadrupolo Analizadores. La principal limitación de este enfoque es que el analista primero debe definir qué iones de producto y/o pérdidas neutrales son específicos para la clase específica de productos naturales. DFF permite el descubrimiento posterior de todos los productos naturales relacionados dentro de una muestra compleja, incluyendo nuevos compuestos. En este trabajo, demostramos la efectividad de la DFF mediante el cribado de extractos de Microcystis aeruginosa, una prominente floración de algas dañina que causa cianobacterias, para la producción de microcistina.

Introduction

LA espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método de espectrometría de masas ampliamente utilizado que implica aislar un ion precursor e inducir la fragmentación mediante la aplicación de energía de activación como la disociación inducida por colisión (CID)1. La forma en que un fragmento de iones está íntimamente ligado a su estructura molecular. Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares en lugar de como un único químico único2. Como tal, compuestos estructuralmente relacionados que son parte de la misma clase biosintética a menudo comparten características de fragmentación de MS/MS clave, incluyendo iones de productos compartidos y/o pérdidas neutrales. La capacidad de detectar muestras complejas para compuestos que poseen iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales es una estrategia poderosa para la detección de clases enteras de compuestos, lo que podría llevar al descubrimiento de nuevos productos naturales3, 4 , 5 , 6. durante décadas, los métodos de espectrometría de masas como el escaneo de pérdida neutra y el escaneo de iones precursor realizado en instrumentos de baja resolución han permitido la detección de iones con la misma pérdida neutra o iones de producto. Sin embargo, los iones o transiciones específicos debían definirse antes de realizar los experimentos. Como los espectrómetros de masas de alta resolución se han vuelto más populares en los laboratorios de investigación, las muestras complejas ahora se examinan comúnmente utilizando métodos de adquisición dependientes de datos (DDA) no dirigidos. En contraste con la pérdida neutra tradicional y el escaneo de iones precursores, los compuestos estructuralmente relacionados pueden identificarse mediante el análisis posterior a la adquisición7. En este trabajo, demostramos una estrategia que hemos desarrollado denominado filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF)5,6, un enfoque sencillo y fácil de usar para detectar clases enteras de compuestos dentro de matrices complejas. Este módulo DFF se ha implementado en la plataforma de código abierto MZmine 2 y está disponible descargando MZmine 2,38 o versiones más recientes. DFF permite a los usuarios de pantalla eficientemente los datasets de DDA para espectros MS/MS que contienen iones del producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para clases enteras de compuestos. Una limitación de DFF son los iones de producto característicos y/o las pérdidas neutrales para una clase de compuestos deben ser definidos por el analista.

Por ejemplo, cada una de las más de 60 micotoxinas fumonisina diferentes identificadas como8,9 poseen una cadena lateral tricarballylic, que genera un ion m/z 157,0142 (C6H5O5-) deproducto al fragmentación de la [M-H] ion4. Por lo tanto, todas las fumonisinas putativas en una muestra pueden detectarse utilizando DFF mediante la detección de todos los espectros MS/MS dentro de un DataSet de DDA que contienen el ion de producto m/z 157,0142 prominente. Del mismo modo, los compuestos sulfados pueden detectarse mediante la detección de datasets DDA para espectros MS/MS que contengan una pérdida diagnóstica neutra de 79,9574 da (SO3)3. Este enfoque también se ha aplicado con éxito para la detección de nuevos péptidos cíclicos5 y productos naturales que contienen residuos de triptófano o fenilalanina6.

Para demostrar la efectividad de dff y su facilidad de uso dentro de la plataforma mzmine10, hemos aplicado este enfoque al análisis de microcistinas (MCS); una clase de más de 240 toxinas relacionadas estructuralmente producidas por las cianobacterias de agua dulce11,12,13.

Las cicotoxinas más comúnmente reportadas son MCS, con el congénere MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) más frecuentemente estudiado (figura 1). Los MCs son heptapéptidos monocíclicos no ribosómicos, biosintetizados por múltiples géneros de cianobacterias incluyendo Microcystis, Anabaena, Nostoc, y Planktothrix12,13. Los MCs se componen de cinco residuos comunes y dos posiciones variables ocupadas por los aminoácidos L. Casi todos los MCs poseen un residuo característico de β-Amino ácido 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-ácido dienoico (ADDA) en la posición 511.  Las vías de fragmentación de MS/MS de MCS se describen bien14,15; el residuo de ADDA es responsable del producto prominente de MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), así como otros iones de producto incluyendo m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figura 2). Los datasets de DDA no dirigidos de extractos celulares de Microcystis aeruginosa pueden ser examinados para todas las microcistinas presentes utilizando estos iones diagnósticos, ya que las microcistinas tienen un residuo de ADDA.

Protocol

1. preparación de los datasets de cromatografía líquida no objetivo (LC)-MS/MS Nota: DFF se puede realizar utilizando cualquier espectrómetro de masas de alta resolución y un método analítico optimizado para una clase objetivo de analitos. Las condiciones de LC-MS/MS optimizadas para MC en el espectrómetro de masas Orbitrap se enumeran en la tabla de materiales. Descargar MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)Nota: los datos de ejemplo CP…

Representative Results

La gráfica DFF generada tras el análisis de M. aeruginosa CPCC300 se muestra en la figura 4. El eje xde esta gráfica es el m/z de los iones precursores que satisfacen los criterios definidos de DFF, mientras que el eje ymuestra el m/z de todos los iones de producto dentro de los espectros de MCS MS/MS. Para este análisis, los criterios para la detección de MC incluyeron iones precursores dentro del rango m…

Discussion

La DFF es una estrategia rápida y directa para detectar clases enteras de compuestos, especialmente relevantes para el descubrimiento compuesto de productos naturales. El aspecto más importante de DFF es definir los criterios específicos de fragmentación de MS/MS para la clase de compuestos específica. En este ejemplo representativo, DFF se usó para detectar todos los residuos de Adda que contienen MCs presentes en un extracto celular de M. aeruginosa . Aunque la gran mayoría de los MCs contienen un resid…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Heather Roshon (centro de cultura phycological canadiense, Universidad de Waterloo por proporcionar la cultura de las cianobacterias estudiadas y Sawsan Abusharkh (Universidad de Carleton) para la asistencia técnica.

Materials

Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300 CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE CPCC300 https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software) software http://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2 software http://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive Orbitrap Thermo Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLC Agilent Equipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 column Agilent 959757-902 Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade Methanol Fisher A456-4
OptimaLC-MS grade Acetonitrile Fisher A955-4
OptimaLC-MS grade Water Fisher W6-4
LC-MS grade Formic Acid Fisher A11710X1-AMP
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21 Thermo Scientific 75-772-436
Altro
Amber HPLC vials 2 mL/caps Agilent 5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filters Pall Corp. 4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters Sigma-Aldrich WHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L) Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mg Sigma-Aldrich C2786
KNO3, 100 mg Sigma-Aldrich P8291
NaNO3, 50 mg Sigma-Aldrich S5022
Na2SO4, 40 mg Sigma-Aldrich S5640
MgCl6H20, 50 mg Sigma-Aldrich M2393
Sodium glycerophosphate, 100 mg Sigma-Aldrich G9422
H3BO3, 20 mg Sigma-Aldrich B6768
Bicine, 500 mg Sigma-Aldrich RES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HO Sigma-Aldrich E6635
FeCl3 ·6H2O Sigma-Aldrich 236489
MnCl2·4H2O Baker 2540
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
Na2MoO4·2H2O Baker 3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution Sigma-Aldrich C3061-500mL

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
McMullin, D. R., Hoogstra, S., McDonald, K. P., Sumarah, M. W., Renaud, J. B. Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis. J. Vis. Exp. (147), e59712, doi:10.3791/59712 (2019).

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