Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In de afgelopen decennia, Cytometry methoden zijn een krachtig instrument om het hematopoietische systeem te onderzoeken in de BM. Deze methodes omvatten fluorescentie-geactiveerde Stroom Cytometry en de nieuwe methode van CyTOF gebruikend zware metaal-geëtiketteerde antilichamen. Ze hebben geleid tot ontdekkingen van vele soorten cellen in een heterogene biologisch specimen door identificatie van hun unieke oppervlakte marker expressieprofielen. Verhoogde spectrum overlappingen die geassocieerd zijn met meer kanalen leidt tot hogere gegevens onnauwkeurigheid in fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen. Daarom worden ongewenste cellen routinematig verwijderd om de cel populaties van belang te verrijken voor fluorescentie-activated flow Cytometry analyse. Bijvoorbeeld, Ly6G (of GR-1) en CD11b worden beschouwd als volwassen myeloïde Cell markers en Ly6G⁺ (of GR-1⁺) en CD11b⁺ cellen worden routinematig verwijderd uit BM monsters met behulp van magnetische verrijking kits voorafgaand aan flow Cytometry analyse van hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) of door het combineren van deze markers in een dump cocktail kanaal^1,2,3. Een ander voorbeeld is dat neutrofielen routinematig uit menselijk bloed specimen worden verwijderd om perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor immunologische studies te verrijken. Hele beenmerg geïsoleerd van de muis of de mens, echter, is zelden onderzocht intact voor Cytometry analyse.

Onlangs is CyTOF een revolutionair hulpmiddel geworden om het hematopoietische systeem^4,5,6te onderzoeken. Met CyTOF, worden de fluorophore-geëtiketteerde antilichamen vervangen door zwaar element reporter-geëtiketteerde antilichamen. Deze methode maakt het mogelijk voor de meting van meer dan 40 markers gelijktijdig zonder de zorg van het spectrum overlap. Het heeft de analyse van intact biologisch specimen zonder pre-uitputtings stappen of een stortplaats kanaal toegelaten. Daarom kunnen we het hematopoietische systeem uitvoerig bekijken met een hoge-inhoud dimensionaliteit van conventionele 2-D flow Cytometry percelen. Cel populaties weggelaten in het verleden tijdens uitputting of gating proces kan nu worden gebracht in het licht met de High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF^4,5. We hebben een antilichamen paneel ontworpen dat gelijktijdig 39 parameters in het hematopoietische systeem meet met een focus op de myeloïde linage⁷. Vergeleken met de conventionele flow Cytometry gegevens, de interpretatie en visualisatie van de ongekende single-cell High-dimensionale gegevens gegenereerd door CyTOF is een uitdaging. Computationele wetenschappers hebben ontwikkeld dimensionaliteit reductie technieken voor de visualisatie van High-dimensionale datasets. In dit artikel, gebruikten we het algoritme, viSNE, die t-Distributed stochastische buurman inbedding (t-GND) techniek gebruikt om de CyTOF gegevens te analyseren en om de High-dimensionale resultaat presenteren op een 2-dimensionale kaart, terwijl het behoud van de High-dimensionale structuur van de gegevens^8,9,10. Op de tSNE plot worden soortgelijke cellen gegroepeerd in subsets en de kleur wordt gebruikt om de functie van de cellen te markeren. Bijvoorbeeld, op Figuur 1 worden de myeloïde cellen verdeeld in meerdere cel subsets gebaseerd op de gelijkenissen van hun expressie patronen van 33 oppervlakte markers vloeide voort uit CyTOF (Figuur 1)⁴. Hier hebben we onderzocht muis beenmerg met onze eerder gemelde 39-marker CyTOF panel door viSNE Analysis⁷. viSNE analyse van onze CyTOF gegevens bleek een niet-geïdentificeerde cel populatie die zowel HSPC (CD117⁺) en neutrofiele (Ly6G⁺) kenmerken (Figuur 2)⁷toonde.

Samenvattend, presenteren wij een protocol om vers geheel beenmerg voor CyTOF analyse te verwerken. In dit artikel, gebruikten we muis beenmerg als een voorbeeld, terwijl dit protocol kan ook worden gebruikt voor het verwerken van menselijk beenmerg monsters. De details die specifiek zijn voor het menselijk beenmerg monsters zijn ook vermeld in het protocol als goed. Het voordeel van dit protocol is dat het Details zoals incubatietijd en temperatuur bevat die werden geoptimaliseerd om neutrofiele-Lineage cellen in het gehele beenmerg te bewaren om onderzoek op het intacte gehele beenmerg toe te laten. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor fluorescentie-activated flow Cytometry toepassingen.