好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

過去数十年の間に、サイトメトリー法はBMの人工システムを調査するための強力なツールとなっています。これらの方法には、蛍光活性化フローサイトメトリーおよび重金属標識抗体を用いたCyTOFの新しい方法が含まれる。彼らは、独自の表面マーカー発現プロファイルを同定することにより、異種生物標本における多くの細胞型の発見につながった。より多くのチャネルに関連するスペクトルの重複が増加すると、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションのデータ不正確性が高くなります。したがって、蛍光活性化フローサイトメトリー分析のために目的の細胞集団を濃縮するために、不要な細胞を日常的に除去する。例えば、Ly6G(またはGr-1)およびCD11bは成熟した骨髄細胞マーカーと見なされ、Ly6G⁺⁽またはGr-1+)およびCD11b+細胞は、フローサイトメトリー分析の前に磁気濃縮キットを使用してBMサンプルから定期的に除去される。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)または1つのダンプカクテルチャネル1、2、3でこれらのマーカーを組み合わせることによって。もう一つの例は、好中球がヒト血液試料から日常的に除去され、免疫学的研究のために末梢血単核細胞(PBMC)を濃縮することである。しかし、マウスまたはヒトから分離された全骨髄は、サイトメトリー分析のために無傷で調査されることはめったにない。

最近、CyTOFは、ヘマトポエティックシステム4、5、6を調査するための画期的なツールとなっています。CyTOFでは、フルオロフォ標識抗体は、重元素レポーター標識抗体に置き換えられます。この方法は、スペクトルの重なりを気にすることなく、同時に40以上のマーカーの測定を可能にします。それは前の枯渇のステップかダンプチャネルなしで無傷の生物標本の分析を可能にした。そのため、従来の2次元フローサイトメトリープロットから高含有量の次元性を持つヘマトポエティックシステムを総合的に見ることができます。枯渇またはゲーティングプロセス中に過去に省略された細胞集団は、CyTOF4,5によって生成された高次元データを用いて明らかになるようになりました。我々は、骨髄リネー^ジ7に焦点を当てた血統系の39のパラメータを同時に測定する抗体パネルを設計した。従来のフローサイトメトリーデータと比較して、CyTOFによって生成された前例のない単一細胞高次元データの解釈と可視化は困難です。計算科学者は、高次元データセットの可視化のための次元低減技術を開発しました。本稿では、T分散確率的近傍埋め込み(t-SNE)技術を用いてCyTOFデータを解析し、高次元構造を保存しながら2次元地図上で高次元結果を提示するアルゴリズムviSNEを用いた。データの^8,9,10.tSNE プロットでは、同様のセルがサブセットにクラスタ化され、色を使用してセルのフィーチャが強調表示されます。例えば、図1では、ミエロイド細胞は、CyTOF(図1)4に起因する33の表面マーカーの発現パターンの類似性に基づいて、複数の細胞サブセットに分布している。ここでは、viSNE分析7により、以前に報告された39マーカーCyTOFパネルを用いてマウス骨髄を調べた。CyTOFデータのviSNE分析は、HSPC(CD117+)と好中球(Ly6G+)特性(図2)7の両方を示した未確認細胞集団を明らかにした。

結論として、我々はCyTOF分析のための新鮮な全骨髄を処理するためのプロトコルを提示する。この記事では、マウスの骨髄を例に、このプロトコルはヒト骨髄サンプルの処理にも使用できます。ヒト骨髄サンプルに特異的な詳細は、プロトコルにも記載されています。このプロトコルの利点は、インキュベーション時間や温度などの詳細が含まれており、骨髄全体の好中球系統細胞を維持し、無傷の骨髄全体の調査を可能にする。このプロトコルは、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションに対しても容易に改変されてもよい。