Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

Under de senaste decennierna, cytometri metoder har varit ett kraftfullt verktyg för att undersöka hematopoetiska systemet i BM. Dessa metoder inkluderar fluorescensaktiverad flödescytometri och den nya metoden för CyTOF med hjälp av tunga metallmärkta anti kroppar. De har lett till upptäckter av många cell typer i ett heterogent biologiskt prov genom att identifiera deras unika profiler för ytmärknings uttryck. Ökade spektrum överlappningar som är förknippade med fler kanaler leder till högre data innoggrannhet i Fluorescence-aktiverade flödescytometri applikationer. Därför avlägsnas oönskade celler rutinmässigt för att berika cell populationer av intresse för fluorescens-aktiverade flödescytometri analys. Till exempel, Ly6G (eller gr-1) och CD11b anses mogna myeloida cell markörer och Ly6G⁺ (eller gr-1⁺) och CD11b⁺ celler rutinmässigt avlägsnas från BM prover med hjälp av magnetiska anriknings satser innan flödescytometri analys av hematopoetisk stam och stamceller (hspcs) eller genom att kombinera dessa markörer i en dumpa cocktail kanal^1,2,3. Ett annat exempel är att neutrofiler rutinmässigt avlägsnas från humant blod prov för att berika perifera mononukleära blod celler (PBMC) för immunologiska studier. Hela benmärgen isolerad från mus eller människa, emellertid, unders öks sällan intakt för cytometri analys.

Nyligen har cytof blivit ett revolutionerande verktyg för att undersöka det hematopoetiska systemet^4,5,6. Med CyTOF ersätts de fluorophore-märkta anti kropparna av tunga element reporter-märkta anti kroppar. Denna metod möjliggör mätning av över 40 markörer samtidigt utan oro spektrum överlappning. Det har möjliggjort analysen av intakt biologiskt prov utan pre-utarmning steg eller en dump kanal. Därför kan vi se hematopoetiska systemet omfattande med hög-innehåll dimensionalitet från konventionella 2-D flödescytometri tomter. Cell populationer som tidigare uteslutits under utarmningen eller gating-processen kan nu föras in i ljuset med de högdimensionella data som genereras av cytof^4,5. Vi har utformat en anti kropps panel som samtidigt mäter 39 parametrar i det hematopoetiska systemet med fokus på myeloida radantal⁷. Jämfört med konventionella flödescytometri-data är tolkningen och visualiseringen av de exempellösa encellig högdimensionella data som genereras av CyTOF utmanande. Computational forskare har utvecklat dimensionalitet reducerings tekniker för visualisering av högdimensionella DataSet. I denna artikel använde vi algoritmen, viSNE, som använder t-Distributed Stochastic granne inbäddning (t-SNE) teknik för att analysera CyTOF data och presentera den höga-dimensionella resultat på en 2-dimensionell karta samtidigt bevara den högdimensionella struktur av data^8,9,10. På den tSNE tomt, liknande celler klustrade i under grupper och färgen används för att markera funktionen i cellerna. Till exempel, på bild 1 är de myeloida cellerna fördelade på flera cell grupper baserat på likheter mellan deras uttrycks mönster av 33 ytmarkörer som är resultatet av cytof (figur 1)⁴. Här undersökte vi mus benmärg med vår tidigare rapporterade 39-markör CyTOF panel av viSNE analys⁷. viSNE analys av våra CyTOF data avslöjade en oidentifierad cell population som visade både HSPC (CD117⁺) och neutrofila (Ly6G⁺) egenskaper (figur 2)⁷.

Sammanfattnings vis presenterar vi ett protokoll för att behandla färsk hel benmärg för CyTOF-analys. I denna artikel, vi använde mus benmärg som ett exempel, medan detta protokoll kan också användas för att behandla mänskliga benmärgs prov. Även de uppgifter som är specifika för humana benmärgs prov noteras i protokollet. Fördelen med detta protokoll är att den innehåller detaljer såsom inkubations tid och temperatur som optimerats för att bevara neutrofila celler i hela benmärgen för att möjliggöra utredning av intakt hel benmärg. Detta protokoll kan också lätt ändras för fluorescensaktiverade flödescytometri applikationer.