Summary

Использование одной молекулы флуоресцентные в гибридизации Situ (SM-рыбы) для Quantify и Localize mRNAs в мышиных ооцитов

Published: April 24, 2019
doi:

Summary

Можно воспроизвести подсчитать количество мРНК в отдельных ооцитов, одной молекулы РНК флуоресцирования на месте гибридизации (РНК-рыбы) был оптимизирован для non сторонник клеток. Ооциты были собраны, гибридизированных конкретных датчиками Стенограмма и количественно с помощью программного обеспечения количественной оценки изображения.

Abstract

Нынешние методы, обычно используемые для количественного определения мРНК в яйцеклеток и эмбрионов включают цифровые реверс транскрипция полимеразной цепной реакции (dPCR), количественные, реальном времени RT-PCR (RT-ПЦР) и РНК последовательности. Когда эти методы выполняются с помощью одной яйцеклетки или эмбриона, низкий копия mRNAs надежно не обнаруживаются. Для преодоления этой проблемы, яйцеклеток или эмбрионов могут быть объединены вместе для анализа; Однако это часто приводит к высокой изменчивости среди образцов. В этом протоколе мы описывают использование флюоресценции в гибридизации situ (рыба) с помощью разветвленной ДНК химия. Этот метод определяет пространственное распределение mRNAs в отдельных клетках. Когда техника связан с местом нахождения и отслеживания программного обеспечения, обилие mRNAs в ячейке также может быть определена количественно. Используя эту технику, есть снижение изменчивости в экспериментальной группе и меньше яйцеклеток и эмбрионов обязаны обнаружить существенные различия между экспериментальной группы. Коммерчески доступные разветвленной ДНК SM-рыба наборы были оптимизированы для выявления mRNAs в секционного тканей или сторонником клетки на слайдах. Однако ооциты не эффективно придерживаться слайды и некоторые реагенты из комплекта были слишком тяжелыми, результате лизис ооцитов. Для предотвращения этого лизиса, некоторые изменения были внесены комплектом рыбу. В частности ооцитов permeabilization и мыть буферы предназначены для иммунофлюоресценции яйцеклеток и эмбрионов вместо несвободных буферов. Permeabilization, моет и инкубаций с датчики и усилители выполнены в 6-ну пластины и ооциты были размещены на слайды в конце протокола, с помощью установки средств массовой информации. Эти изменения были в состоянии преодолеть ограничения, коммерчески доступных комплект, в частности, лизис ооцитов. Для герметизации и точно подсчитать количество мРНК в отдельных ооцитов, компьютерного программного обеспечения был использован. Вместе этот протокол представляет собой альтернативу ПЦР и последовательности для сравнения выражения конкретных протоколов в одиночных клетках.

Introduction

Обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (ПЦР) был золотым стандартом для мРНК quantitation. В настоящее время используются два анализов, цифровой ПЦР (dPCR)1 и количественных, реальное время ПЦР (ПЦР)2 . Из двух методов ПЦР dPCR имеет большую чувствительность, чем ПЦР предполагая, что он может использоваться для измерения mRNA изобилия в одиночных клетках. Однако в наших руках, dPCR анализ низкого залегания mRNAs в бассейнах 5 до 10 яйцеклеток за каждый экспериментальный образец выпустила данных с низкой воспроизводимостью и высокий вариант3. Это, вероятно, из-за экспериментальной ошибки, связанной с РНК добыча и эффективности обратной транскрипции. РНК последовательности также была выполнена с помощью мыши и человеческих яйцеклеток4,5. Этот метод требует cDNA амплификации шаги, необходимые для библиотеки поколения, которое вероятно увеличивает изменчивость в экспериментальной группе. Кроме того низкие изобилии стенограммы не может быть обнаружено. Хотя последовательности цены снизились за последние несколько лет, это может быть дорого из-за высокой стоимости биоинформатики анализов. Наконец мРНК Локализация — это динамичный процесс с пространственных изменений, способствующих белков функции6. Таким образом мы намереваемся принять метод, который будет производить точные и воспроизводимые количественные показатели и локализации индивидуальных mRNAs в одно ооцитов.

Разветвленный ДНК, в сочетании с флуоресценции в гибридизации situ усиливает сигнал флуоресценции, вместо того, чтобы усилительных благоприятных обнаружение РНК/кДНК одной мРНК в отдельных клетках 7,8,9. Генотипирования через серию гибридизации, амплификация (с помощью разветвленной ДНК) и флуоресценции маркировки шаги для того, чтобы усилить флуоресценции сигнала7. Этот метод начинается с привязки 18 – 25-base олигонуклеотида зонд пар, которые дополняют конкретные мРНК3,8,10. Пятнадцати до двадцати зонд пары предназначены для обеспечение специфику каждого Стенограмма для целевого транскрипт. МРНК конкретных гибридизации следуют предварительный усилитель и усилитель зондами, которые формируют разветвленную конфигурации. Приблизительно 400 лейбл флуорофоров привязку каждого усилителя, что привело к увеличению 8000-fold в флуоресцировании, позволяя обнаружения индивидуальных mRNAs (рис. 1)11.

Figure 1
Рисунок 1: Схема протокола SM-рыба. Последовательные гибридизации Стенограмма конкретного ПЭП, разветвленной ДНК усилитель и Флюорофор к цели, которую показана mRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Предыдущие исследования с использованием одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (SM-рыбы) локализованные β-актина mRNAs в12 отдельных нейронов и ДНК вируса папилломы человека в рак шейки матки клеток линии7. Компьютерное программное обеспечение, месте нахождения и отслеживания Программа идентифицирует отдельных пунктата флуоресцентного сигнала и успешно используется для количественного определения количество мРНК в каждой ячейке3,13.

Основываясь на результаты обнаружения мРНК в нейроны12, мы предположили, что SM-рыб окажется полезным инструментом для quantitate Стенограмма уровней в мышиных яйцеклеток и эмбрионов, включая низкие изобилии мРНК. Однако техника оптимизирована для использования с фиксированной адэрентных клеток и формальдегида фиксированной парафин встроенных разделов ткани (FFPE). Ооциты не может присоединиться к слайду, даже когда они покрыты с поли-L-лизин. Кроме того они являются более хрупкие, чем соматических клетках и результате лизис клеток когда подвергаются некоторые несвободные буферов в коммерчески доступные комплекты3разделах ткани. Для преодоления этих проблем, ооциты фиксировали и вручную переведен между капли буферов. Кроме того permeabilization и мыть буферов в наборы были заменены уменьшить lysis клетки. Встроенные датчики приобретаются вместе с комплектом рыбу или конкретных протоколов могут запрашиваться. Каждого собственности зонда набор доступен в одном из трех каналов флуоресцирования (C1, C2 и C3) для мультиплексирования. В ходе текущего эксперимента мышиных ооциты были двойной окрашенных и количественных, используя зонд Nanog C2 и C3 Pou5f1 зонда. Эти зонды были отобраны на основе сообщенных выражения Nanog и Pou5f1 яйцеклеток и эмбрионов. В заключение гибридизации шаги ооциты были помещены в капли анти затухания монтажа СМИ для приложения гистологические слайды. Конфокальный изображения были использованы для количественного определения количество пунктата флуоресцентные сигналов, которые представляют индивидуальных mRNAs. Помимо количественного мРНК, изображений также показал пространственное распределение конкретные мРНК в ячейке, какие другие методы количественного определения РНК не в состоянии достичь. Этот метод оказался низким изменчивости в пределах экспериментальной группы, что позволяет использовать меньшее количество яйцеклеток в каждой экспериментальной группе выявить существенные различия между экспериментальной группы3.

Protocol

Животных процедуры были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в университете штата Небраска-Линкольн и все методы были исполнены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Для этого исследования, Беспородные CD-1 мышей …

Representative Results

После завершения протокола, результат будет отдельных изображений из конфокальный z серии (рис. 4а и 5), склеенные изображения (рис. 4 c), и рассчитывает мРНК (рис. 4B). Когда выполняе…

Discussion

Ряд мелких шагов во время протокол обеспечит успешное флуоресценции и точное количество мРНК. Во-первых протокол должны быть выполнены сразу после сбора и фиксации яйцеклеток. Обратите внимание, что PVP добавляется в буфер фиксации параформальдегида 4% для предотвращения ооциты от прил?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Даниэль р. Ларсон за его щедрую помощь с установки и использования местом поиска и отслеживания программы 13 и технической поддержке Университета Небраска Линкольн микроскопии Core для воображения confocal микроскопии. Это исследование представляет собой вклад Университета Небраска сельскохозяйственных исследований отдела, Линкольн, штат Небраска и была поддержана UNL Люк фондов (NEB-26-206/присоединения номер-232435 и НЭБ-26-231/присоединения номер-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

Riferimenti

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. . Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

Play Video

Citazione di questo articolo
Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

View Video