Summary

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Published: April 24, 2019
doi:

Summary

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Abstract

정기적으로 oocytes에서 배아 mRNA를 측정 하는 데 사용 하는 현재 방법 디지털 역 전사 연쇄 반응 (dPCR), 양적, 실시간 RT-PCR (RT-정량) 및 RNA 시퀀싱 포함 됩니다. 이러한 기술은 단일 oocyte 또는 배아를 사용 하 여 수행 됩니다, 낮은 복사 mRNAs 안정적으로 검색 되지 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 oocytes 또는 배아 수 수 풀링된 함께 분석; 그러나,이 종종 샘플 중 높은 가변성에 이어집니다. 이 프로토콜에서 우리 형광 제자리 교 잡 (물고기) 분기 DNA 화학을 사용 하 여의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 개별 셀에서 mRNAs의 공간적 패턴을 식별합니다. 기술은 자리 찾아서 추적 컴퓨터 소프트웨어와 결합 되어 때 셀에서 mRNAs의 풍부도 측정할 수 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 실험적인 그룹에서 감소 변화 이며 적은 oocytes 및 배아 실험 그룹 간의 중요 한 차이 검출 해야. 상업적으로 사용 가능한 분기 DNA SM-물고기 키트 sectioned 조직 또는 슬라이드에 부착 세포 mRNAs를 검색에 최적화 되었습니다. 그러나, oocytes 효과적으로 슬라이드에 고착 하지 않는다 고 일부 시 약 키트에 oocyte 세포의 결과로 너무 가혹 했다. 이 세포의 용이 해를 방지 하기 위해, 물고기 키트 여러 수정 되었다. 특히, oocyte permeabilization 및 워시 버퍼를 oocytes와 태아의 면역 형광을 위한 독점 버퍼를 교체 했습니다. Permeabilization, 세척, 그리고 프로브와 앰프 외피 6 잘 플레이트에서 수행한 고 oocytes 슬라이드 설치 미디어를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 배치 했다. 이러한 수정 상용 키트, 특히, oocyte 세포의 한계를 극복할 수 있었다. 정확 하 게 그리고 reproducibly 개별 oocytes에서 mRNAs의 수를 계산, 컴퓨터 소프트웨어 사용 되었다. 함께,이 프로토콜 PCR 및 시퀀싱을 비교할 단일 셀에 특정 성적 표현 하는 대안을 나타냅니다.

Introduction

역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)1 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)2 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화3. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, mRNA 지역화 단백질 기능6에 기여 하는 공간 변경 동적 과정 이다. 따라서, 우리는 정확 하 고 재현 가능한 정량적 측정 및 단일 oocytes에서 개별 mRNAs의 지역화 생성 하는 기술 채택에 밖으로 설정.

분기 DNA 형광 제자리 교 잡에서에 결합 된 개별 셀 7,,89단일 mRNAs의 증폭 RNA/cDNA 활성화 탐지 보다는 형광 신호를 증폭 한다. 분석 결과 교 잡, 증폭 (분기 DNA를 사용 하 여), 및 형광 형광 신호7증폭 하기 위하여 단계를 라벨의 시리즈를 통해 수행 됩니다. 기술은 특정 mRNA3,,810를 보완 하는 18-25 베이스 oligonucleotide 조사 쌍의 바인딩으로 시작 합니다. 15 ~ 20 프로브 쌍 대상 성적에 대 한 각 사본 보장 특이성에 대 한 설계 되었습니다. MRNA 전용 하이브리드 프리 앰프 및 증폭기 프로브 분기 구성 구성 하 옵니다. 약, 400 라벨 fluorophores 개별 mRNAs (그림 1)11의 탐지를 허용 하는 형광에 8000-fold 증가 결과로 각 증폭기에 바인딩합니다.

Figure 1
그림 1: SM 물고기 프로토콜의 도식. 대 본 특정 조사의 순차적 교 잡 DNA 증폭기 및 mRNA 표시 대상에 fluorophore 분기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

개별 뉴런12 에 인간 유 두 종 바이러스 DNA에 자 궁 경부 암 제자리 교 잡 (SM-물고기) 지역화 된 β-말라 mRNAs에 있는 단일 분자 형광을 사용 하 여 이전 연구 라인7세포. 자리 찾기는 컴퓨터 소프트웨어 및 추적 프로그램 개별 punctate 형광 신호를 식별 하 고 각 셀3,13mRNAs의 수 척도를 성공적으로 사용 되었습니다.

신경12mRNA 검색의 결과 바탕으로, 우리 SM 물고기 quantitate murine oocytes에서 배아 낮은 풍부 mRNAs를 포함 한 성적 수준에 유용한 도구를 증명할 것을 가정 했다. 그러나, 기술은 부착 고정된 셀과 함께 사용 하기 위해 최적화와 포름알데히드 파라핀 고정 임베디드 (FFPE) 조직 단면도. Oocytes 그들은 폴 리-L-리 신을 코팅 하는 경우에 슬라이드를 준수 수 없습니다. 또한, 그들은 체세포와 직물 단면도 세포 세포의 용 해 상용 키트3독점 버퍼의 일부를 받게 될 때의 결과 보다 더 약 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해 oocytes는 고정 되었고 수동으로 버퍼의 방울 사이 전송. 또한, 키트에 permeabilization 및 워시 버퍼 세포 세포의 용 해를 감소 시키기 위하여 대체 되었다. 미리 디자인 된 프로브 물고기 키트와 함께 구입 또는 특정 성적 증명서를 요청할 수 있습니다. 각 독자적인 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, 및 C3) 다중화 허용 중 하나에. 현재 실험에 murine oocytes 듀얼 스테인드과 C2 Nanog 프로브와 C3 Pou5f1 프로브를 사용 하 여 계량 했다. 이 프로브 oocytes에서 배아 Nanog Pou5f1 의 보고 된 식에 따라 선정 됐다. 교 잡 단계의 결론에 oocytes 조직학 슬라이드에 응용 프로그램에 대 한 방지 페이드 설치 미디어의 방울에 배치 했다. 공초점 이미지 개별 mRNAs를 대표 하는 punctate 형광 신호 수 계량에 사용 되었다. 영상 또한 셀에 특정 mRNA의 공간적 분포를 보였다는 mRNAs를 측정 이외에 다른 RNA 정량화 방법 달성할 수 없습니다. 이 기술은 실험 그룹3사이의 중요 한 차이점을 식별 하기 위해 각 실험 그룹에 oocytes의 작은 숫자의 사용을 허용 하는 실험적인 그룹 내에서 낮은 다양성을 입증 했다.

Protocol

동물 절차 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 네브래스카 링컨의 대학에 의해 승인 했다 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 이 연구에 대 한 CD-1 outbred 쥐 정상적 설치류 차 우와 물; ad libitum 접근 했다 그들은 어두운 12시 12분에 유지 되었다: 빛을 주기. 1입니다. 필요한 미디어의 준비 기본 미디어 (OMM), 살 균 물 100 mL를 100 mM NaCl, KCl 5mm, 0.5 m…

Representative Results

프로토콜 완료 되 면 결과 (그림 4A , 그림 5), 맞춘된 이미지 (그림 4C), confocal z 시리즈에서 개별 이미지를 있을 것입니다 그리고 mRNA 계산 (그림 4B). 다중화를 수행 하는 경우 또한 병합 된 이미지를 보여주는 두 개의 다른 mRNAs (<strong class="xf…

Discussion

일련의 작은 단계 프로토콜 동안 mRNAs의 성공적인 형광 및 정확한 보장 합니다. 첫째, 프로토콜 수집과 oocytes의 고정 후에 즉시 수행 되어야 합니다. Note PVP oocytes 서로에 집착 하지 않도록 4 %paraformaldehyde 고정 버퍼에 추가 됩니다. 우리 컬렉션은 oocytes의 고정 후 즉시 실험을 수행 하는 데 필요한 발견. 어떤 지연 결과 훨씬 낮은 형광 신호를 녹취 록의 undercounting 귀 착될 것입니다. 이것은 때문에 RNA …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

설치 및 사용 자리 찾아서 추적 프로그램 13 의 confocal 현미경 이미징에 대 한 대학 네브라스카 링컨 현미경 코어의 기술 지원 그의 관대 한 도움에 감사 박사 다니엘 R. 라 슨 하 고. 이 연구는 네브라스카 농업 연구 부문, 링컨, 네브라스카 대학에의 기여도 나타냅니다과 UNL 해치 자금 (코-26-206/가입 번호-232435 및 코-26-231/승인 번호-1013511)에 의해 지원 되었다.

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

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