Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.
Auto-immune ziekten presenteren een aanzienlijk gezondheidsrisico Last. Fundamentele vraagstukken met betrekking tot de ontwikkeling en de progressie van auto-immune ziekte onbeantwoord. Een voorwaarde voor vooruitgang in ons begrip van de onderliggende ziekte mechanismen en de dynamiek van de cellulaire is de precieze koppeling van de microanatomical locatie van cel subsets met stroomafwaartse moleculaire of functionele analyses; een doel dat is van oudsher moeilijk te bereiken. De ontwikkeling van stabiele photoactivatable biologische fluorophores en hun integratie in de verslaggever spanningen heeft onlangs precieze microanatomical labeling en bijhouden van cellulaire deelverzamelingen in lymfkliertest modellen. Hier beschrijven we hoe de mogelijkheid om het analyseren van autoreactieve lymfocyten van één germinal centra kan helpen te bieden van nieuwe inzichten in autoimmuniteit, waarbij de combinatie van een roman chimeer model van autoimmuniteit met een verslaggever van de photoactivatable als voorbeeld . We tonen dat een procedure voor het genereren van gemengd chimaeren met spontane autoreactieve germinal centra bevolkt door lymfocyten uitvoering van een verslaggever van de groen fluorescente proteïne photoactivatable. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated door twee-foton microscopie. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens worden geanalyseerd of stroom cytometrically, gesorteerd als afzonderlijke cellen of in bulk, en kunnen worden onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses. Deze aanpak kan direct worden toegepast om vernieuwde inzichten op het gebied van auto-immuniteit, maar de procedure voor het genereren van beenmerg Chimaera en de procedure photoactivation daarnaast brede toepassing vindt in onderzoek naar infectieziekten en tumor uitzaaiingen.
De incidentie van auto-immune ziekte is snel gestegen in de afgelopen decennia, met name in westerse samenlevingen. Vandaag, auto-immune ziekte rangen derde op de lijst van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld1. Fundamentele vraagstukken met betrekking tot de ontwikkeling en de progressie van auto-immune ziekte onbeantwoord. Een voorwaarde voor vooruitgang in ons begrip van de onderliggende ziekte mechanismen en de dynamiek van de cellulaire is de precieze koppeling van de microanatomical locatie van cel subsets met stroomafwaartse moleculaire of functionele analyses. In het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van een aantal stabiele photoconvertible, photoactivatable of photoswitchable biologische fluorophores en hun integratie in de verslaggever stammen de precieze microanatomical labeling en volgen van mobiele deelverzamelingen in lymfkliertest modellen.
Kaede, een photoconvertible fluorescerende eiwitten die afkomstig zijn uit een stony koraal, ondergaat onomkeerbare photoconversion van groene fluorescentie te rode fluorescentie bij blootstelling aan UV- of ultraviolet licht2. Aanvankelijk werkzaam te volgen van het dynamisch gedrag van afzonderlijke cellen in het ontwikkelen van organotypic hersenen segmenten3, werd generatie een Kaede knock-in muis vervolgens toegestaan toezicht cellulaire beweging in vivo, en het systeem toegepast op analyses van immuun cel migratie naar en uit lymfklieren4. Deze aanpak werd later verfijnd met een tweede generatie verslaggever5. Een soortgelijke verslaggever is Dendra6, die onlangs werd gebruikt voor het bijhouden van de lymfeknoop metastasen in vivo7.
De eerste photoactivatable eiwit ontwikkeld was een groen fluorescente proteïne (GFP) gebouwd met een enkel punt Mutatie (T203H), wat leidt tot een zeer lage absorptie in de regio van de golflengte van 450 tot 550 nm8. Na photoactivation door violet licht, dit photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) schakelt de absorptie maximale uit ~ 400 tot ~ 500 nm, opbrengst een benaderende 100-fold intensiteit toenemen wanneer opgewekt met een golflengte van 488 nm. De generatie van transgene muizen waarin alle hematopoietische cellen PA-GFP uitspreken toegestaan, voor de eerste keer, diepgaande analyses van B-celselectie in anatomisch gedefinieerde lichte en donkere zones van de germinal center9.
Overwegende dat de photoactivation is een onomkeerbare omzetting van een niet-fluorescerende staat in een fluorescerende staat, en photoconversion is een eenzijdige overgang van één golflengte naar de andere, kunnen photoswitchable eiwitten shuttle tussen beide voorwaarden10 . Deze laatste functie was onlangs ingezet om ingenieur optische controle van eiwit activiteit11.
Gebruik makend van de PA-GFP-verslaggever, kenmerkte we onlangs de repertoires van de B-cel van één germinal centra in een nieuw model van spontane lupus-achtige autoimmuniteit12. Dit model is gebaseerd op gemengde chimaeren met 1 deel beenmerg herbergen een autoreactieve B-cel receptor knock-in met specificiteit voor ribonuclear-eiwitcomplexen (564Igi13,14) gecombineerd met 2 delen het beenmerg van een gewenste donor. Op ongeveer 6 weken post reconstitutie, worden homeostatische voorwaarden bereikt die spontane autoreactieve germinal centra in de milt en de lymfeklieren cutane aanwezig zijn. Met name het germinal center B-celpopulatie is vrijwel uitsluitend (~ 95%) samengesteld uit cellen die zijn afgeleid van het compartiment niet-564Igi, en deze B wild-type-afgeleide cellen geworden autoreactieve. Daarom is het model laat toe een ‘plug-and-play’ benadering van analyses van autoreactieve germinal center B cellen met behulp van verschillende transgenen en uitsparingen verslaggevers. Hier beschrijven we de procedure voor het genereren van gemengde chimaeren met spontane autoreactieve germinal centra bevolkt door lymfocyten uitvoering van de PA-GFP-verslaggever. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated met behulp van een twee-foton microscoop. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens worden geanalyseerd door stroom cytometry of gesorteerd fluorescerende-activated cell sorting (FACS) en onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses. De mogelijkheid om het analyseren van autoreactieve lymfocyten van één germinal centra kan rechtstreeks worden toegepast op vernieuwde inzichten op het gebied van auto-immuniteit, maar de technieken en benaderingen beschreven kunnen bovendien relevante toepassingen vinden in studies van infectieziekten en tumor uitzaaiingen.
Een groot aantal lymfkliertest modellen van autoimmuniteit beschikbaar zijn, waarvan vele presenteren met spontane germinal centra16. Echter, veel van de beschikbare modellen haven complexe genetische achtergronden of mutaties in centrale regelgevers van lymfocyt proliferatie of activering, waardoor ze slecht geschikt voor intercrossing met verslaggever lijnen en studies van normale lymfocyt gedrag in autoimmuniteit, respectievelijk. Het huidige model, integendeel, laat een ‘plug-and-play’ benadering van grondige analyses van autoreactieve wild-type-afgeleide germinal center B cellen met elke gewenste combinatie van transgenen, knock-outs en verslaggevers, in het onderhavige geval vertegenwoordigd door photoactivatable GFP. Met behulp van in vivo labeling strategieën, kunnen interne germinal centra worden gevisualiseerd in transplanteren lymfoïde weefsels en hun cellulaire bestanddelen photoactivated met behulp van een twee-foton microscoop. Photoactivated lymfocyten van één germinal centra kunnen vervolgens geanalyseerd of gesorteerde stroom cytometrically, als afzonderlijke cellen of in bulk. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderworpen aan extra downstream moleculaire en functionele analyses te bieden van nieuwe inzichten op het gebied van auto-immuniteit.
Er zijn enkele kritische stappen voor de succesvolle uitvoering van deze procedure. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, bestraling (1.100 Rad) en donor beenmerg reconstitutie vervangen met succes het compartiment van de ontvangende beenmerg oplevert in de buurt van-volledige chimerism in het compartiment B-cel. Dit is een belangrijk punt, zoals residuele ontvanger-afgeleide B cellen van een subset van de populatie germinal center maken zou ‘donker’. Ongeacht de bron voor bestraling gebruikt, moet de dosis/timing van bestraling worden geoptimaliseerd om maximale myeloablative effect met minimale collaterale weefselschade zwichten voor de dieren. Voor reconstructie, het bot-crush-protocol en de reconstitutie met 20 miljoen totale donor cellen geconstateerd krachtig opbrengst hoge reconstitutie graden. Werken van steriele en koude/op ijs voor de extractie van het beenmerg zorgt voor een hoge levensvatbaarheid van de donor beenmerg. Om te bereiken de gewenste donor beenmerg ratio’s, is het essentieel te oefenen grote zorg wanneer tellen aliquots van cellen, zowel voor de telling zelf en bij het nemen van uit de deelsteekproef van het beenmerg om te tellen. Mengen en co pillering de donor courgettes, in plaats van centrifugeren en resuspending afzonderlijk en dan mengen, dient om te voorkomen dat eventuele schuintrekken in donor verhoudingen na het tellen van de cel.
De gemengde beenmerg chimera generatie van het protocol kan stand-alone en hierdoor generatie chimaeren met autoreactieve germinal centra met gewenste verslaggever, transgenic of knock-out. Een beperking hieraan is echter de noodzaak om histocompatibel donoren. De 564Igi-stam is op een C57Bl/6J congenisch achtergrond, en dientengevolge de andere donor en de ontvangers moeten hebben een achtergrond van de congenisch H-2b (of als alternatief, de 564Igi-stam moet worden backcrossed naar de gewenste spanning en het auto-immune fenotype gecontroleerd op de nieuwe achtergrond). De bestraling procedure neiging om het voordeel van een tolerogenic omgeving17, en incongruenties in sommige kleine histocompatibility antigenen kunnen worden getolereerd. Echter moet dit aspect grondig overwegen, met name als mengen van mannelijke en vrouwelijke donoren en/of ontvangers, als gevolg van het potentieel voor vrouwelijke reactiviteit met man-beperkte Y-antigenen.
Ook het aspect van de photoactivation van het protocol kan zelfstandig, en kan worden gebruikt in vele verschillende contexten. Echter is de PA-GFP-verslaggever is momenteel alleen beschikbaar met de promotor van UBC, die actief is in alle cellen van de hematopoietische afkomst, maar niet in stromale cellen. Zoals vermeld in de inleiding, andere photoactivatable, photoswitchable of photoconvertible verslaggever stammen zijn beschikbaar, en kunnen worden vervangen door PA-GFP, met de juiste aanpassing van de experimentele omstandigheden.
Het is belangrijk om te voorkomen dat onbedoelde photoactivation van ongewenste gebieden, door het behoud van de laser ruim boven de 900 nm wanneer imaging, als deze golflengte zal niet photoactivate PA-GFP. Voor de photoactivation zelf, specifieke instellingen, zoals laser macht en pixel nadruktijd, hangt af van de diepte in het weefsel en de specifieke weefsel gebruikt de imaging systeem en elke toepassing moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke imaging systeem gebruikt. Let erop niet aan photodamage de cellen, maar het is tegelijkertijd noodzakelijk om efficiënte photoactivation in de stack, om een voldoende vertegenwoordiging van geactiveerde cellen voor downstream analyses. Germinal center B-cellen in het algemeen vormen overal van 0,5% tot ~ 2% van de milt of cutane lymfeklier B-cellen, en kan worden gezien vanaf de representatieve resultaten (Figuur 5), photoactivated één germinal center B cellen ~ 1% van de totale kunnen make-up bevolking in een enkele milt segment aanwezig. Succesvolle analyse of sorteren van een aanzienlijk aantal cellen vereist daarom een groot aantal gebeurtenissen te verwerken.
The authors have nothing to disclose.
SE Degn is een Fellow van de Lundbeckfonden en Carlsberg Stichting Distinguished Fellow. Dit werk werd gedeeltelijk bovendien gesteund door een NNF biomedische Grant (SE Degn).
Antibody, 9D11-A568 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255 | |
Antibody, 9D11-A647 | In-house generated | 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031 | |
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | 110705 | |
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) | Biolegend | 144613 | |
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) | Biolegend | 142403 | |
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 | Biolegend | 102717 | |
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 | Biolegend | 103235 | |
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized | Fisher Scientific | 211766 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Conical tubes, 50 mL | Falcon | 352235 | |
Cover slip, square, 22×22 mm, 0.13-0.17 mm | Thermo Fisher Scientific | 22X22-1 | |
EDTA | Merck | 1,084,180,250 | |
Ethanol, 70% | VWR | 8301.360 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Flow cytometer, FACS Canto II | BD Biosciences | 338962 | |
Flow cytometer, LSRFortessa SORP | BD Biosciences | – | Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm) |
Grease, high vacuum, Dow Corning | VWR | DOWC1597418 | |
Hemocytometer, Burker-Türk | VWR | 630-1544 | |
Isoflurane, IsoFlo vet. | Orion Pharma | 9658 | |
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) | Cedarlane | CL5035 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) | Sarstedt | 72.690.550 | |
Microscope, Two-photon | Prairie Technologies (now Bruker) | – | Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope |
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml | VWR | 410-0110 | |
NaHCO3 | Merck | 1063290500 | |
Needle, 18 gauge | BD Medical | 304622 | |
NH4Cl | VWR | 87,769,290 | |
PBS | Sigma | d8537 | |
Pestle homogenizer | VWR | 47747-358 | |
Pestle, unglazed, 175 mm | VWR | 410-0122 | |
Pipette, Serological, 10 ml | VWR | 612-3700 | |
Pipette, transfer, plastic | Sarstedt | 861,172,001 | |
Plastic paraffin film (Parafilm M) | Bemis | PM996 | |
Plate, 96-well | Falcon | 353910 | |
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps | FST – Fine Science Tools | 91197-00 | |
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight | FST – Fine Science Tools | 91460-11 | |
Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ES1 | |
Syringe, 20 mL | Terumo | SS-20ES1 | |
Syringe, 5 mL | Terumo | SS-05S1 | |
Syringe, Insulin, 0.3 cc | BD Medical | 324827 | |
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml | MSD Animal health | 431577 | |
Trypan blue solution, 0.4% | VWR | K940-100ML | |
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |