면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문

모든 동물 사용 유럽 공동체 지침을 준수 하 고 덴마크 동물 연구 검사자 (2017-15-0201-01348)에 의해 승인 되었다. 1. 일반 마우스 축산 및 버퍼 및 도구 준비 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 표준 지침에 따라 건강 상태를 정기적으로 모니터링을 집 마우스 라인. 선택 사항: 순진한 쥐 비 모니터링 우발적인 감염 때문에 자발적인 어린 싹 센터의 부재를 확인 합니다. 이 면역 형광 검사 현미경 검사 법 (어린 싹 센터 구조의 존재)에 의해 할 수 있다 또는 흐름을 앞에서 설명한12cytometry (어린 싹 센터 B 세포의 주파수).참고: 어느 여성 또는 남성을 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 섹스의 불일치가 발생할 수 있습니다 이론적으로 남성 Y 항으로 alloreactivity 여성 받는 사람/기증자15로 섹스 일치 기증자와 받는 사람에 이상적입니다. 사용 CD45.1 받는 사람 (b 6. SJL-Ptprc는는 Pepcb/BoyJ) 나이의 6-10 주 주변에. 564Igi를 사용 하 여 (b 6. Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) 및 PA-GFP (나이의 6-12 주에 B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) 기증자. 압력가 마로 소독 하 여 수술 도구 (똑바로 잘가 위 및 Dumont 집게 # 5와 #7) 소독 일상적인 소독 지침에 따르면 그들. 500 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), pH 7.4에 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 포함 하 골 (BM) 버퍼를 준비 합니다. BM 버퍼를 준비 하려면 추가 열 비활성화 (1 시간 보완을 비활성화 하는 56 ° C 물 목욕에서)의 10 mL FBS와 1.25 mL 500 ml PBS, pH 7.4, 및 잘 혼합 (pH 7.4에 조정) 400 mM EDTA 솔루션의. 0.2 µ m 필터 플라스 크를 사용 하 여 버퍼를 필터링 합니다. 시 약 학년 물 총 볼륨의 10 mL를 10 배 재고의 1 mL를 diluting 하 여 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼 (155mm NH4Cl, 12 m m NaHCO3, 0.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 합니다. 5 m m EDTA, pH 7.4 PBS의 50 mL를 준비 합니다. 2입니다. 혼합된 골 키메라의 설립 받는 사람 (0 일)의 조사 CD45.1 골 수 받는 사람 컨테이너를 적절 한 방사선 놓고 1100으로 비추는 방사선 감마 irradiator에.참고: 대체 방사선 소스를 사용할 수 있습니다. 소스에 관계 없이 복용량/타이밍 동물에 최소한의 부수적인 조직의 손상 최대한 myeloablative 효과를 최적화할 수 있다. 항생제에 물 ad libitum (1 mg의 sulfadiazin 및 trimethoprim/mL 식 수의 0.2 mg). 뼈 (주 1)의 추출 4 %isoflurane 공기에서의 지속적인 흐름에 의해 564Igi 골 수 기증자를 anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 에탄올과 기증자 아래로 스프레이 흐름 후드에서 무 균 수술 패드에 그들을 배치. 살 균 버퍼 및 장비를 사용 하 여 살 균 조건을 유지 작업을 진행 합니다. 대 퇴 골과 경골, 먼저 발목 주위 절 개 한 똑바로 잘가 위를 사용 하 여 엉덩이를 위쪽으로 확장. 몸 쪽으로 다리를 끄고 using 중장비 집게 또는 엄지와 집게 손가락, 피부를 당겨. 마찬가지로 아래로 발 떨어져 피부를 당겨. 엉덩이에서 다리를 잡아와 강제로 발을 당겨 무릎과 발목 관절에 밖으로 팝업. 발목 관절 휴식과 경골, 그로 인하여 힘 줄과 근육 경골 오프 스트립에 들고 하는 동안 발을 몸 쪽으로 당겨 이동 합니다. 무릎을 공동 출시 경골, 휴식 하 고 유사 하 게 함으로써 스트립 힘 줄과 근육은 대 퇴 골에서 대 퇴 골에 들고 하는 동안이 몸 쪽으로 당겨. 엉덩이 관절에 절 개를 확인 하 고는 힘 줄을 잘라 다음 엉덩이 소켓에서 대 퇴 골을 꺼내. 단계 2.2.2-2.2.4 contralateral 측면에 대 한 반복 합니다. 거친 종이 타월로 나머지 모든 근육과 결합 조직을 제거 하기 위해 그들을 문 지르고 하 여 뼈를 신중 하 게 청소. 다음 그들에 린스 차가운 BM 버퍼 마침내 Dumont #7 집게의 쌍을 사용 하 여 얼음에 신선한 찬 BM 버퍼에 그들을 전송 하기 전에. PA GFP 기증자에 대 한 2.2 단계를 반복 합니다.참고: 단일 기증자 로부터 골 수 세포의 수는 성별과 나이 따라 다릅니다. 받는 사람 원하는 수와 원하는 입력된 골 비율 및 숫자에 따라 기증자의 수를 확장. 기증자 부족 한 경우, 정면 사지 골 추출에 포함할 수 있습니다. 이 일반적으로 추가 1/3 ½ 뒷 다리 사지에서 얻은 세포의 생성 합니다. 일반적으로, 어디서 나 50-200 백만 셀에서 복구할 수 있습니다 기증자, 나이, 성별, 배경 및 여부만 뒷 다리 또는 뒷 다리와 앞 다리는 포함에 따라 당. 골 수 세포 추출 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼에서 rinsing 하 여 박격포를 준비 합니다. 린스 버퍼 배수와 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 전기 피펫은 컨트롤러를 사용 하 여 신선한 얼음 BM 버퍼의 10 mL를 추가. Dumont #7 집게의 쌍을 사용 하 여 박격포를 564Igi 기증자 로부터 뼈를 전송 사용 하는 유 봉 분쇄 하 고 출시 골 뼈 분쇄. 골 추출 물 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 발음 하 고 얼음에 50 mL 튜브에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 박격포를 신선한 얼음 BM 버퍼의 추가 10 mL을 추가 하 고 셀의 완전 한 복구를 보장 하기 위해 반복. 종이 타월로 박격포에서 뼈 재료를 제거 하 고 적절 하 게, 삭제 70% 에탄올, BM 버퍼 다음으로 신중 하 게 박격포를 헹 굴. PA GFP 골 수 기증자 그룹에 대 한 2.3 단계를 반복 합니다. 골 수 세포를 계산 micropipette를 사용 하 여 플라스틱 파라핀 영화의 조각에 RBC 세포의 용 해 버퍼의 40 µ L을 포함 하는 물방울을 놓습니다. 반전 564Igi 골 관 몇 번 하 고는 micropipette를 사용 하 여 aliquot 10 µ L을 꺼내. RBC 세포의 용 해 버퍼 드롭의 40 µ L와 함께 믹스. 그 후 드롭 Trypan 블루 (수성 해결책에서 0.4%)의 50 µ L를 추가 합니다. Burker-터키어 hemocytometer 및 현미경 조사 결과 믹스의 10 µ L를 즉시 로드 합니다. 총 희석 요인 x 10을 사용 하 여 mL 당 셀의 수를 계산 합니다. 적절 한 세포 생존 능력을 확인 > 90%. PA GFP 골 수 기증자 그룹에 대 한 2.4 단계를 반복 합니다. 기증자 정지를 준비 건의 단계 2.4 및 원하는 받는 사람 수에 따라 달라 집니다, 기증자 혼합 관에서 혼합 두 기증자 그룹의 각각에서 골 수 기증자의 볼륨을 계산 합니다.참고: 예: 1:2 혼합된 564Igi:PA의 한 그룹을 설정-6 CD45.1 받는 GFP 키메라: 2 부품 PA-GFP와 각 받는 사람 필요 20 x 106 기증자 세포 총, 1 부 564Igi. 따라서,이 10 x 20 x 6 x 1/3를 요구 한다6 = 40 x 106 564Igi 기증자 세포 및 6 x 2/3 10 x 20 x6 = 80 x 106 PA GFP 기증자 세포. 50 mL 원뿔 튜브에 PA-GFP와 564lgi 기증자 수의 적절 한 금액을 믹스. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 10 분 동안 골 혼합물 g 와 4 ° C x 200에서 원심. 가만히 따르다는 상쾌한 고 mL 당 1 x 108 셀의 밀도에 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼에 셀 resuspend. 얼음에 microcentrifuge precooled 1.5 mL 튜브에 전송. 골 수 기증자와 받는 사람 골 수를 재구성 4% isoflurane 3.75% 유지 보수 다음 공기에서의 지속적인 흐름으로 유도 사용 하 여 받는 사람 anesthetize 발가락-핀치 반사의 부재에 의해 마 취의 적절 한 평면을 확인 합니다. 신중 하 게 포함 하는 보장, 골 수 세포의 적절 한 물의 resuspension 골 믹스 (~ 106 셀 x 20), 0.3 mL의 aspirate 200 µ L을 골 혼합 튜브 영화, 30 게이지 인슐린 주사기. 받는 사람 옆에 배치, 위와 약간 ‘ 눈을 밖으로 팝업 ‘ 눈 아래 피부를 부드럽게 스트레칭, 부드럽게 눈 소켓, 주변 조직과 눈을 피하기 위해 돌의 앞에 30 ° 각도로 약 주사기의 끝을 삽입. 바늘의 팁은 눈 소켓을 밑줄 뼈를 만질 때, 약간 철회 (~0.5 m m)와 꾸준한 압력을 사용 하 여 골 기증자를 천천히 주입.참고: 이어야 한다 아무 출혈, 액체 및 더 주입 시 눈의 아주 사소한 불 룩 하 누설 없음. Ad libitum 항생제 물으로 케이지를 마우스를 반환 하 고 프로시저에서 즉시 복구 확인 합니다. 각 받는 사람에 대 한 2.6 단계를 반복 합니다.그러나 참고: 꼬리 정 맥 주입 retroorbital 주입 비슷한 결과 대신에 사용할 수 있습니다, 그리고, 우리의 손에서 그것은 상당히 느린 받는 사람의 큰 그룹으로 작업할 때 문제가 있을 수 있습니다. 포부 및 질 식 위험 포즈 직접 작은 직경 침구 anaesthetized 동물의 복구 피해 야 한다 제거 하는 항생제 물 (14 일) cage(s)에서 항생제 물을 제거 하 고 신선한 일반 식 수를 바꿉니다. 3. 성공적인 재구성을 검사 하 고 chimerism (주 6)의 적절 한 학위를 확인 Retroorbital 키메라와 컨트롤의 출혈 받는 사람 귀 태그 숫자 microcentrifuge 튜브 1.5 mL 라벨 5 mM EDTA를 포함 하는 PBS의 50 µ L을 추가 하 여 혈액 컬렉션 튜브를 준비 합니다.참고: PA-GFP, CD45.1 및 CD45.2, 및 9D 11 (idiotype)에 대 한 적절 한 컨트롤을 포함 합니다. 이것은 1를 포함 하 여 행 해질 수 있다 PA-GFP + 마우스, 1 CD45.1 마우스, 1 b 6 마우스 및 1 564Igi 마우스. 마우스를 anesthetize 고 마 취 단계 2.6.1에서의 적절 한 평면을 확인 합니다. 부드럽게 위와 약간 ‘ 눈을 밖으로 팝업 ‘ 눈 아래 피부를 스트레칭, 그것의 측면에 키메라를 놓습니다. 부드럽게 눈과 주위 조직 손상을 방지 하도록 눈 소켓의 앞에 약 40 ° 각도에서 BoPET 포장 heparinized 모 세관 튜브 (60 µ L 내부 볼륨)를 삽입 합니다. 부드럽게 트위스트/회전 튜브 피와 채우기 위해 시작 될 때까지. 수 동적으로 모 세관 작용 때까지 거의 완전히 풀로 튜브를 채우기 위해 혈액을 허용 다음 튜브를 철회 하 고 즉시 눈을 있도록 눈 주위 한 파악을 푸는 동시에 해당 사전 이라는 컬렉션 튜브 장소 위치로 다시 침전 하는. 출혈은 즉시 중지 해야 합니다. 모 세관 튜브 컬렉션 튜브에 비운은 고 sharps 용기에 그것을 폐기. 튜브를 닫고 PBS/EDTA와 완전 한 혼합 되도록 세 번 반전. 마우스 케이지를 반환 하 고 프로시저에서 즉시 복구 확인. 각 실험 마우스와 적절 한 컨트롤에 대 한 3.1 단계를 반복 합니다.참고:이 방법은 전에이 완벽 하 게 재구성은 우발적인 감염 조사 받는 사람에 대 한 더 큰 위험 포즈 수 있습니다 submandibular 정 맥 빵 꾸를 사용 하 여 주의 가져가 라. 또한, 우리의 경험에서 우리는 혈액의 수집 그리고 분실 과도 한 출혈로 인해 혈액의 양이 더 많은 변수 찾으십시오. 골 수 키메라는 재구성 단계에서 중요 한 새로운 골 수는 완전히 engrafted 조 정상 수준을 다시 시작 하기 전에 이러한 사항을 모두 중요 하다. 말 초 혈액 단 세포 (PBMC) 정화 짧게 혈액 컬렉션의 완료 후 (10 s) 낮은 속도로 튜브 원심 (< 200 x g)는 희석 수집 하는 튜브의 하단에 혈액 안정. 림프 구 분리 매체와 10 mL 주사기를 18 G 바늘을 연결. 첫 번째 튜브의 아래쪽에 바늘을 삽입 하 고 림프 구 분리 매체의 1 mL와 함께 혈액 샘플을 underlayer. 조심 스럽게 바늘을 철회 하 고 샘플의 교차 오염을 방지 하기 위해 종이 타월로 닦아냅니다. 모든 예제를 통해 진행 하십시오 다음 낮은/오프로 설정 하는 브레이크와 함께 800 x g, 스윙 양동이 원심 분리기에서 실내 온도에에 25 분 동안 원심. 대응 하 게 레이블이 1.5 mL의 집합 차가운 BM 버퍼의 1 mL를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 준비. 각 샘플에 대 한 다음 원심 분리 200 µ L micropipette 위 (플라즈마) 레이어를 입력 하 고 바로 인터페이스 위에 단 셀 (MNC) 레이어를 발음. BM 버퍼의 1 mL를 포함 하는 대응 하 게 레이블이 지정 된 튜브에 세포를 전송. 뚜껑 닫고 혼합을 반전 합니다. 림프 구 분리 매체 포함 된 튜브를 삭제 합니다. 모든 예제를 통해 진행 하십시오 하 고 200 x g 5 분, 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 원심. 발음 하 고 상쾌한, 삭제 차가운 BM 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 샘플 항 체 얼룩이 지 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비가 있다. 흐름 cytometric 평가 위한 얼룩참고: 제안 패널: CD45.1 FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9 D 11-A568, CD45.2-APC. 비 활성화 PA-GFP 태평양 오렌지 (또는 동등한) 채널에서 검색 됩니다. 아니 생존 염료는 림프 구 분리 되 면 죽은 세포의 제거로 필요 합니다. micropipette 사용 하 여, 96 잘 접시에 각 키메라 및 제어 샘플을 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다. 3 비 PA GFP 컨트롤 샘플에 대 한 나머지 100 µ L 각 샘플 (총 300 µ L)의 수영장. 흠 없는 제어 및 단일 스테인드 제어 우물을 위한이 물자의 50 µ L를 추가 합니다. PA-GFP에 대 한 단일 스테인드 제어 또한 흠 없는 PA GFP 샘플의 50 µ L를 추가 합니다. 각 잘 버퍼 (흠 없는) 100 µ L를 추가, 단일 항 체 (단일 스테인드 보상 제어, PA GFP 보상 제어 제외) 또는 항 체 믹스 (샘플). 20 분 동안 얼음에 품 어. 4 ° c.에 5 분 동안 200 x g 에서 원심 버퍼를 터치 합니다. 각 우물에 BM 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 다시 씻어 원심. 버퍼에 밖으로 터치 한 각 잘 BM 버퍼의 200 µ L에서 셀 resuspend 합니다. 샘플 분석 흐름 cytometer (그림 1)에 대 한 준비가 있다.참고:는 키메라에 어린 싹 센터 응답 6 주 이후부터 언제 든 지 분석할 수 있습니다. 4. vivo에서 단일 본 원 센터의 식별을 돕기 위해 한계 영역/subcapsular 공동의 라벨 참고: 현재 프로토콜 노상 강도/호크 (오 금 림프절)과 정 맥 (i.v., 비장) 주사에 대 한 증명은 되지만 대상 사이트는 다양 한 수 있습니다. 오 금 림프절 라벨에 대 한 양자 노상 강도 주입 2.6.1 단계 에서처럼 마우스 anesthetize 1.5 mL microcentrifuge 관에서 2 µ L의 PBS, pH 7.4의 18 µ L에서 PE 라는 쥐 반대로 마우스 CD169 항 체 희석. 한 조각의 플라스틱 파라핀 영화에 10 µ L 각 혼합물의의 두 방울을 배치 합니다. 30 게이지 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 각 방울 발음 라벨에 믹스는 노상 강도 10 µ L를 주입 (노상 강도, 인접 발가락의 시작 부분에서의 중앙 부분에 5-10 ° 각도로 바늘으로 입력 하 고 약 중간 뒤꿈치 쪽으로 바늘을 삽입) 또는 호크 (바늘 5-입력 10 ° 뒤꿈치 바로 위에 각도 위치에 대 한 삽입의 무릎 쪽으로 방향에서 아 킬 레 스 힘 줄의 축 길이 절반). 그들의 감 금 소를 생쥐를 반환 하 고 5 단계를 계속 하기 전에 대략 15 분을 기다립니다. 비장 라벨에 대 한 정 맥 주입 포인트 2.6.1에서 마우스 anesthetize 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 PBS의 90 µ L에서 PE 라는 쥐 반대로 마우스 CD169 항 체의 10 µ L를 희석. 인슐린 주사기 0.3 mL와 혼합을 발음. 수행 단계 2.6에 의하여 retroorbital i.v. 주입 합니다. 그들의 감 금 소를 생쥐를 반환 하 고 5 단계를 계속 하기 전에 대략 15 분을 기다립니다.참고: isoflurane, 케 타 민/Xylazine 혼합 사용할 수 있습니다;와 같은 마 취 주사 대신으로 그러나,이 일반적으로 느린 복구 시간으로 이어집니다. 림프 배수는 일반적으로 골격 근육 운동에 의해 영향을, 이후이 느린 배수 시간이 이어질 예정 이다. 5. explanting 비장 및 림프절 및 photoactivation에 대 한 준비 이중 면 이미징 및 photoactivation 챔버 준비 20 mL 주사기에서 플런저를 제거 하 고 다시 로드 그것 진공 그리스와 그것에 진공 그리스의 튜브의 노즐을 삽입 하 여. 다음 5 mL 주사기에서 플런저를 제거 하 고 다시-진공 그리스와 함께 그것은 부하를 20 mL 주사기를 사용 하 여. 진공 그리스 로드 5 mL 주사기를 사용 하 여 사각형 coverslip 평평한 표면에 배치 하 고 진공 그리스 (약 1-2 m m 가장자리에서)으로 coverslip의 가장자리를 따라 추적 하 여 이미징 및 photoactivation 챔버 준비.참고: 침수 물에 유화 진공 그리스의 microdroplets 렌즈 오염 수로 이후에 현미경 렌즈 접촉 모든 표면의 진공 기름 오염 방지 주의. 얼음 처럼 차가운 BM 버퍼와 커버 슬립 진공 그리스 챔버를와 차가운 평평한 표면에 놓습니다. 수확 하는 림프절, 비장 Vivo에서 분류 단계 2.2.1에 의하여 분석할 공상 마우스를 안락사. 70% 에탄올과 시체를 스프레이. 오 금 림프절에 액세스 하려면 바로 무릎 구 덩이 아래 피부에 절 개를 만들기 위해 똑바로 잘가 위를 사용 하 고 엉덩이 관절까지 햄 스트링 라인을 따라 위쪽으로 컷을 거의 확장. Dumont #5 또는 # 7을 사용 하 여 집게, 각각 오 금 fossa (그림 2A)에서 조직 노출 피부 바깥쪽의 노출된 플랩의 당겨. 신중 하 게 오 금 정 맥에 그냥 중간 오 금 fossa을 입력 하 고 해 부 몬 트 #5 집게의 쌍을 사용 하 여 삽입 하 고 개폐는 다리의 축 집게 기본 오 금 림프절을 노출 하려면 지방 열. 엄지 및 집게 손가락 (그림 2B)를 사용 하 여 무릎 근 전면에서 quadriceps 근육을 곤란 하 게 하 여 여 포에서 림프절을 팝. 주변 조직 (그림 2C)에서 그것을 해방 다음 단계 5.1에서에서 준비 진공 그리스 상공에 집게와 림프 노드를 아래에서 잡아. 단계 5.2.2-5.2.4 contralateral 측면에 대 한 반복 합니다. 원하는 경우 여러 개의 림프절 단일 챔버에 장착 될 수 있습니다. 마지막으로 두 번째 coverslip 진공 그리스 테두리 위에 놓고 모든 기포를 돌출 하도록, 부드럽게 눌러 챔버를 닫습니다.참고: 버퍼의 일부 밖으로 뿐만 아니라, 밀어 수 있습니다 하지만 진공 그리스 (그림 2D) 유체의 누설 방지 단단한 물개를 형성 한다. 림프절 양면 이미징 상공에 지금 있다. 비장을 앞쪽 중간 라인에 proximal 마우스의 왼쪽에 복 벽을 통해 절 개 바로 미세가 위의 쌍을 사용 하 여 액세스 하려면 바로 흉 곽, 아래 하 고 뒷부분 axillary 라인에 몸 주위 확장 합니다. 비장의 팁 표시 (그림 3A) 해야 합니다. 뒤 몽 #7 집게의 쌍으로 비장을 당기고 그것을 발표 하기에 유착을 잘라. 똑바로 잘가 위의 쌍을 사용 하 여 잘라 ~ 2 m m 두께, 단면, 슬라이스. 5.1 단계에서 진공 그리스 상공에는 슬라이스를 놓습니다. 원하는 경우 여러 비장 조각은 단일 챔버에 장착 될 수 있습니다. 마지막으로 두 번째 coverslip 진공 그리스 테두리 위에 놓고 모든 기포를 돌출 하도록, 부드럽게 눌러 챔버를 닫습니다. 이미징 및 photoactivation 동안 제외 하 고 모든 시간에 얼음에 모든 이미징 챔버 유지.참고: 버퍼의 일부 밖으로 뿐만 아니라, 밀어 수 있습니다 하지만 진공 그리스 유체의 누설 방지 단단한 물개를 형성 한다. 비장 조각 양면 이미징 챔버 (그림 3B)에 있다. 6입니다. Photoactivation 단일 어린 싹 센터를 식별참고:이 프로토콜은 비장에 대 한 설명 하지만 전적으로 림프절에 대 한 유사. 현미경 단계에 이미징 챔버를 놓습니다. 3.5 mL 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여, 위 coverslip 위에 증류수 한 방울을 배치 및 목표는. 조직 전송된 빛을 사용 하 여 위에 초점. 어두운 모드 및 2 광자 여기로 전환 하 고 940 레이저 조정 nm.참고: 적절 한 필터 세트와 함께이 파장 여기 및 허용 단계 4.2, 주입 CD169 PE로 콜라겐-포함 된 구조 주요 혈관 및 구조 요소와 관련 된 두 번째 고조파 발생의 탐지는 한계 영역을 식별합니다. 그러나, 940 nm 여기 photoactivate PA-GFP 하지 않습니다. 개별 백색 펄프 분야 (CD169-PE 얼룩에 의해 제한) 조직의 표면 근처를 지역화 하 고 중앙 되와 관련 된 두 번째 고조파 발생에 의해 periarteriolar 림프 칼 집 (친구, T 셀 영역)를 식별 합니다. 친구와 한계 영역 사이의 영역에서 찾아 높은 autofluorescent의 존재 활성화 tingible 신체 세포 (모든 채널에 강한 autofluorescent 신호, 어두운 그들으로 blob 같은 모습) (그림 4A).참고: 필요한 경우, 조직의 바람직하지 않은 방향으로, 이미징 챔버가 성을 상실 될 수 있습니다 및 이미징 다른 방향에서 수행할 수 있습니다. 6.1.3 단계에서 식별 하는 특징에 따라., 단일 새싹 센터의 영역을 식별 하는 관심 영역을 그립니다. Z-의 스택 주위를 설정 100-150 µ m 깊이, 조직, 표면에서 시작 하 고 ~ 3 µ m의 단계 크기를 사용 하 여. 830 nm 여기 파장으로 전환 합니다. 차단 또는 감지기에 photodamage를 방지 하기 위해 모든 채널을 어둡게 (로 레이저 파워 및 출력 형광은 일반적으로이 파장에 극적으로 더 높은), 그리고 다음 스택 ‘이미지’.참고: 레이저 파워 및 픽셀 망설임 시간 등의 특정 설정을 사용 하 고, 특정 조직의 조직과 이미징 시스템에 깊이에 따라 달라 집니다. 각 응용 프로그램 특정 이미징 시스템 사용에 대 한 최적화할 수 있다. 스택을 통해 효율적인 photoactivation을 얻을 것이 필수적입니다, 하는 동안 한다 주의 하지 photodamage에 셀. 940 nm 여기 파장에 다시 전환 하 고 채널을 다시 합니다. (그림 4B)를 통해 효율적인 photoactivation photodamage (확산, 셀 경계 비 PA GFP 신호, 어두운 반점 또는 photoactivated 지역에서 높은-학위를 autofluorescence)의 부재를 확인 하려면 스택을 통해 스캔. Photoactivate 영상 실에서 모든 관련 조직 이동 합니다 다음 신속 하 게 추가 처리까지 얼음에 그것을 반환 합니다. 추가적인 이미징 챔버의 photoactivation와 함께 진행 합니다.참고: 조직 explanting, 장착 및 특히 photoactivation는 시간이 많이 걸리는 프로세스, 하지만 전체 설정-주위에 세포 생존 능력에 있는 극적인 감소를 방지 하기 위해 4-6 시간을 제한 한다. 7. 복구 및 photoactivated 세포의 분석 임 파선 및 비장 세포의 추출 각 photoactivated 샘플에 대 한 얼음에 BM 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 따라 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 준비. 비-PA-GFP 제어 및 비-활성화 PA GFP 마우스에서 샘플을 포함 합니다. 이 하나의 B6 제어 및 한 PA GFP 컨트롤 마우스를 포함 하 여 수행할 수 있습니다. 조심 스럽게 이미징 챔버 (해당 되는 경우 여러 샘플은 단일 챔버에 존재), 샘플의 위치를 유지 하 고 각 샘플의 각각 샘플 튜브를 돌보는에서 상단 커버 슬립을 제거. 유 봉 균질 화기를 사용 하 여 조직을 짜 내 고 세포 분리를 튜브에는 유 봉 트위스트. micropipette 사용 하 여, lysate를 발음 하 고 신선 하 고, 미리 냉각 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 림프절 샘플, 7.1.5 단계로 건너뜁니다. 비장 샘플에 대 한 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 삭제는 상쾌한 고 RBC 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 incubate 다음 차가운 BM 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 7.1.5 단계로 진행. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 삭제는 상쾌한 고 차가운 BM 버퍼의 200 µ L에서 resuspend. 원하는 경우는 샘플 흐름 cytometric 평가 대 한 얼룩 및 정렬에 대 한 준비가 있다. 흐름 cytometric 평가 위한 얼룩참고: 제안 패널: CD169 PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9 D 11-A647, CD38-PE-Cy7, 고칠 수 생존 염료 Efluor-780, GL7-태평양 파랑. 비 활성화 PA-GFP 태평양 오렌지 (또는 동등한) 채널에서 검색 됩니다. Photoactivated 펜 실바 니 아-GFP GFP 채널에서 검색 됩니다. (하 수도 되지 않았을 수도 vivo에서 CD169 PE와 함께 표시) 모든 공동 순화 된 대 식 세포는 CD169 PE와 얼룩 덤프 게이트로 이것을 사용 하 여 제외할 수 있습니다. micropipette 사용 하 여, 96 잘 접시에 각 키메라 및 제어 샘플을 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다. B6 컨트롤 샘플에 대 한 흠 없는 제어 및 단일 스테인드 제어 우물을 위한이 물자의 50 µ L를 추가 합니다. PA-GFP 비 활성화에 대 한 단일 스테인드 제어 또한 흠 없는 비 활성화 PA GFP 샘플의 50 µ L를 추가 합니다. 활성화 된 PA GFP 단일 스테인드 컨트롤에 대 한 모든 photoactivated 샘플에 대 한 나머지 자료 수영장. 각 잘, 버퍼 (흠 없는 및 PA GFP 보상 제어)의 100 µ L를 추가, 단일 항 체 (단일 스테인드 보상 컨트롤) 또는 항 체 믹스 (photoactivated 샘플). 20 분 동안 얼음에 품 어. 200 x g 에서 4 ° c.에서 5 분 원심 버퍼를 터치 합니다. 각 우물에 BM 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 다시 씻어 원심. 버퍼에 밖으로 터치 한 각 잘 BM 버퍼의 200 µ L에서 셀 resuspend 합니다. 샘플 분석 흐름 cytometer 또는 정렬 (대표 결과 그림5에서)에 대 한 준비가 있다.