Summary

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Abstract

Agrobacterium sp. 그것이 능력을 전송 하 고 식물의 게놈으로 통합 하는 그것의 자신의 T-DNA 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 널리 사용 되는 방법 중 하나입니다. 여기, 선물이 감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 식물 유전자 수정 두 변환 시스템. A. tumefaciens 변환에서 잎에 감염 하 고 변환 된 셀이 선택 된 새로운 완전 한 변환된 공장 18 주에 phytohormones를 사용 하 여 다시 생성 됩니다. A. rhizogenes 변환, 줄기에 바늘으로 박테리아를 주입 하 여 감염 하 고 새로운 등장된 변환된 털 뿌리는 빨간색 형광 마커를 사용 하 여 검색 한 변형 비 뿌리 제거 됩니다. 5-6 주, 결과 공장에서는 완전 개발된 변형된 털 뿌리는 야생 타입 촬영의 합성입니다. 바이오 매스를 증가, 변형 된 털이 뿌리는 excised 고 자체 전파 될 수 있습니다. 우리는 그것이 suberin 생 합성 유전자 발기인에 의해 주도 거 스 취재 원 유전자를 표현 하는 뿌리를 모두 Agrobacterium-중재 변환 방법 적용. 거 스 얼룩 절차 제공 되 고 발기인 유도의 셀 지역화를 수 있습니다. 두 방법에서 변형 된 감자 뿌리 거 스 GUS 활동 suberized endodermis와 exodermis, 그리고 또한, A. rhizogenes 변형 뿌리에 얼룩이 지기 옆 뿌리 출현에 감지 했다 보여주었다. 이 결과 A. rhizogenes 뿌리에 표현 되는 유전자 연구를 빨리 대체 도구가 될 수 있습니다 것이 좋습니다.

Introduction

경제 관심, 이외에도 유전자 변형 식물의 발생 유전자의 궁극적인 기능을 설명 하 고 이해 식물 생리학 및 개발 연구에 그것의 자신의 관련성을 있다. 가장 널리 사용 되는 방법 식물 DNA 삽입은 Agrobacterium-변화를 중재. Agrobacterium tumefaciens 그 종양 유도 (Ti) 플라스 미드의 행동에 의해 많은 식물 종의 감염된 조직에 크라운 혹을 생성할 수 있다. 플라스 미드는 식물 게놈에 통합 될 것 이다 조직 dedifferentiation1,2를 유도 하는 유전자의 세트와 함께 T-DNA 영역을 포함 합니다. 이 유전자는 transgene로 T DNA 내에서 교환 특정 공장 수정 피하 phenotypic 효력3의 생성을 허용 했다. Transgene T DNA로 복제를 촉진 하기 위하여 T-DNA 영역 Ti 플라스 미드의 유전자의 나머지 부분 동안 이진 플라스 미드 라는 독립적인 플라스 미드에 excised 되어 있다 (T DNA 전송 및 삽입 메커니즘을 수 있는 독성 유전자) 되었습니다 도우미 플라스 미드에 배치. 식물 생명 공학 연구에 대 한 A. tumefaciens 에 의해 변환 여러 이점이 있다: 그것은 비싼 장치를 필요 하지 않습니다, 안정적이 고 일시적인 공장 변환, 및 복사본에 통합 하는 유전자의 낮은 수를 생성할 수는 염색체4. 그러나, 대부분 식물, 하지만 하지 애기, 에 대 한 안정적인 transformants의 세대에서 단일 또는 외 인 phytohormones, 힘들고 시간이 걸리는이 과정을 만들기를 사용 하 여 몇 가지 셀 공장 재생이 필요 합니다. A. rhizogenes 는 또한 식물 게놈 수정 수 털이 뿌리 또는 감염 사이트 루트 유도 (Ri) 플라스 미드5에 인코딩된 rol (루트 loci) 유전자의 표현 때문에 우발적인 뿌리를 생산. 비록 적은 A. tumefaciens보다 공부, A. rhizogenes 또한 유전자 변형 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 이 경우에, A. rhizogenes 는 원래 T-DNA Ri 플라스 미드와 이진 플라스 미드에서 두 번째 T dna는 transgene 운반 포함 되어 있습니다. 감염 사이트 줄기 또는 hypocotyls에 있을 때, 합성 공장 얻어질 수 있다, 새로운 털이 유전자 변형 뿌리 야생 타입 촬영에서 신흥. 또는, 털이 변형 된 뿌리에서 체 외에 탄소 소스 입력 미디어에서 자율적으로 성장할 수 있다. A. rhizogenes A. tumefaciens 유전자 변형 조직을 생산 하는 대신를 사용 하 여 때 루트 대상 기관 공장 재생 필요 하지 않습니다 및 따라서 그것은 빠르고 적은 비용 때문에 관련성을 얻고 있다. 이전 연구는 루트 특정 유전자6,7,,89phenotypic 특성에 대 한 충당이 방법론을 증명 하고있다.

감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 이후는 결 절은 되는 비타민의 좋은 소스에 대 한 인간의 소비에 대 한 영양 관련 식품 및 농업 기구의 국제 연합 (FAO)에 따르면 세계에 있는 제 4 가장 중요 한 작물은 그리고 미네랄입니다. 그 이유로, 감자 농업 생명 공학의 스포트라이트에 배치 되었습니다 고도 유전과 발달에 대 한 좋은 생물 학적 모델10,11으로 여겨진다. 감자 전이 유전자의 특성을 통해 기본 suberized 조직 suberin에 관여 하 고 생 합성12,13,14 왁 스 분자 메커니즘의 이해에 크게 기여 ,15,,1617, suberin 단위체 전송18 및 녹음 방송 규칙19. Suberin feruloyl 전이 효소 유전자, FHT, 이러한 특징이 생 합성 유전자; 중 하나입니다. 그것의 downregulation suberin의 ferulate 에스테 르에 강한 감소 및 감자 괴 경14왁 스와 상관 periderm 보호의 강한 손상에 상승을 제공 합니다. 수반, 뿌리와 애기의 씨앗, 그것의 상 상속 orthologue (ASFT/RWP1)의 녹아웃 suberin20,21에서 알 킬 ferulates 생산의 역할 또한 보여주었다. 감자, FHT transcriptional 기자 선 그리고 FHT 항 체를 보였다 각각는 발기인 활동 및 단백질 exodermis, endodermis, phellogen-파생 상품 및 부상된 조직을15.

이 작품에서는, 우리는 야생 타입 촬영에 유지 되는 유전자 변형 털 뿌리를 생산 하기 위해 A. rhizogenes 를 사용 하 여, 복합 감자 식물, 생성 또는 자율적 에 체 외성장에 excised 프로토콜 선발. 우리는 또한 완전 한 유전자 변형 감자 식물을 얻기 위해 A. tumefaciens 를 사용 하 여 프로토콜을 제공 합니다. 사례 연구로 A. rhizogenes , A. tumefaciens 동일한 바이너리 벡터와 변형 거 스 기자 유전자 발현 운전 FHT 발기인과 함께 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 결과 보고 하 고 비교.

Protocol

A. rhizogenes 변환 프로토콜 적응 되었고 경적 외.7 에서 수정 되었고 유전자 테스트 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레). A. tumefaciens 변환 프로토콜은 적응 배너 외.22 에서 수정 하 고 테스트 genotypes 했다 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레) 및 미 tuberosum ssp. andigena. 두 절차의 주요 단계는 각각 그림 1과 그림 2?…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -감자 전이 중재 이 원고에 A. rhizogenes 와 변환된 루트를 설정 하는 단계별 절차를 제공 됩니다. 그림 1 는 전부 (완전 개발된 털 뿌리를 얻기에 A. rhizogenes 의 주입)에서 약 5-6 주 소요 절차의 개요를 제공 합니다. 다음, 식물 합성 (야생 타입 ?…

Discussion

감자, 안정 되어 있는 완전 한 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 일반적인 시스템 변환 사용 하 여 organogenesis 외 인 phytohormones를 사용 하 여 필요한 Agrobacterium tumefaciens 종자로. Agrobacterium 기반 프로토콜 비 T DNA 벡터 시퀀스25통합 가능성이 있다, 하지만이 방법론 이며 쉬운 아직 덜 비싼 감자 식물을 변환 하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 년 동안, A. rhizogenes?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 정부의 드 Innovación y 많은 (AGL2009-13745, PB FPI 부여), 정부의 드 Economía y Competitividad 페더 (AGL2012-36725, AGL2015-67495-c 2-1-R), 자금 및 지로 나의 대학 (박사 학위 부여 SF, 그랜트를 지원 했다 SING11/1). A. rhizogenes , A. tumefaciens 긴장을 제공 하는 저자는 박사 디트로이트 Broer (토지 이용, 대학 로스 토크, 로스 토크, 독일 연구소) 및 박사 Salomé 프라 트 (센트로 나시오날 드 Biotecnología, 마드리드, 스페인)에 게 감사 각각, 및 박사 Marçal 순간 및 도움말 및 A. rhizogenes 변환 실험 시작에서 받은 지원에 대 한 박사 안 나 플 라 센 시아 (툴루즈 III 폴 Sabatier 대학-CNRS, 식물 연구 실험실 (LRSV), Castanet 돌 루 잔, 프랑스)입니다. 저자는 실험실 작업을 수행 하 고 돌보는 식물, Ferran Fontdecaba 및 지원 칼라 산체스의 일부 실험 하 고 있던 동안에 그녀의 귀중 한 도움에 감사 사라 고메스 (Departament de Biologia, UdG, 지로 나) 그들의 최종 학위 프로젝트입니다.

Materials

Acetone

Panreac

1.310.071.21

Acetosyringone

Acros

115540050

Aquarium pump

Prodac

MP350

Autoclave

Ragpa Strelimatic

Bacteriological agar

Lab Conda

1800

BAP

Duchefa

B0904

Beef extract

Lab Conda

1700

Plant growing cabinet

Nuaire

Carbenicillin

Duchefa

C0109

Cefotaxime sodium

Duchefa

C0111

DMSO

Merck

1029310161

Ecotron infors

HT

29378

Ethanol

Merck

1,009,831,011

Falcon tube

Control tecnica

CFT011500

Ferricyanate

Sigma

101001081

Ferrocyanate

Sigma

100979088

Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture

Apiglass

ref16

GA3

Sigma

G7645

Gamborg B5 media

Duchefa

G0210

Gelrite

Duchefa

G1101

Glucosa

Sigma

G5767

Kanamycin

Sigma

K1377

Leukopor tape

BSN Leukopor

BDF47467

Lupe

Wild-Heerbrugg

M420

Magnetic shaker

Agimatic

7000243

MES hydrate

Sigma

M2933-25G

MgSO4

Panreac

131404

Microscope

Olympus

Minufugue centrifugue 5415R

Eppendorf

Murashige and Skoog media

Duchefa

M0254.0050

Na2HPO4

Panreac

131679

NAA

Duchefa

N0903

NaCl

Panreac

131659

NaH2PO4

Sigma

58282

NightSea Stereo

SFA Moonting Adapter

Parafilm

Anorsa

PRFL-001-001

Peptone

Lab Conda

1616

Petri dishes (90 x 14)

Anorsa

200200

pHmetre

Crison

Phytotron

Inkoa

RFTI-R5485

Plant Agar

Duchefa

P1001

Refrigeratot

Liebherr Medline

Rifampicin

Duchefa

R0146

Spectinomycin

Sigma

59007

Spectrophotometer

Shimadzu

Square plates (120 x 120)

Deltalab

200204

Streptomycin

Sigma

S6501

Sucrose

Panreac

131621

Surgical blades

Swann-Morton

201

Surgical needle

NIPRO

015/0204

Triptone

Lab Conda

1612

Triton

Serva

37240

Unimax 1010 shaker

Heidolph

Vacuum

Dinko

x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)

Biosynth

B-7398

Yeast extract

Lab Conda

1702.00

Zeatin riboside

Sigma

1001042850

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Citazione di questo articolo
Fernández-Piñán, S., López, J., Armendariz, I., Boher, P., Figueras, M., Serra, O. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. J. Vis. Exp. (145), e59119, doi:10.3791/59119 (2019).

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