Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-mediata trasformazione di patate e l'attività del promotore di un Gene di suberina da GUS Staining

A parte di interesse economico, la generazione di piante transgeniche ha una propria rilevanza nella ricerca per dimostrare la funzione dei geni e capire meglio la fisiologia vegetale e sviluppo. Il più diffuso metodo per pianta inserimento del DNA è Agrobacterium-mediata trasformazione. Agrobacterium tumefaciens è in grado di generare corona Galle nel tessuto infetto di molte specie vegetali dall’azione del suo tumore-induzione plasmide (Ti). Il plasmide contiene una regione T-DNA con un set di geni che sarà integrato nel genoma della pianta e indurre il tessuto dedifferenziazione^1,2. Lo scambio di questi geni all’interno del T-DNA di transgene ha permesso la generazione di modifiche specifiche impianto evitando effetti fenotipici³. Per facilitare il transgene clonazione nel T-DNA, regione del T-DNA è stata asportata in un plasmide indipendente chiamato un plasmide binario, mentre il resto dei geni del plasmide Ti (i geni di virulenza che consentono i meccanismi di trasferimento e inserimento di T-DNA) sono stati collocato in un plasmide helper. Per ricerca di biotecnologia della pianta, trasformazione di a. tumefaciens ha diversi vantaggi: essa non ha bisogno di costosi dispositivi, è in grado di generare sia trasformazione in pianta stabile e transitoria e basso numero di copie sono integrate nel gene la cromosoma⁴. Tuttavia, per la maggior parte delle piante, ma non, di Arabidopsis la generazione di trasformanti stabile richiede la rigenerazione della pianta da una sola o poche cellule utilizzando esogeni fitormoni, rendendo questo processo laborioso e che richiede tempo. A. rhizogenes è anche in grado di modificare il genoma della pianta, producendo radici pelosi o radici avventizie presso i siti di infezione a causa dell’espressione dei geni rol (radice loci) codificato in radice-induzione (Ri) plasmide⁵. Anche se meno studiata rispetto a. tumefaciens, a. rhizogenes è utilizzato anche per ottenere radici transgeniche. In questo caso, a. rhizogenes contiene l’originale T-DNA nel plasmide Ri e un plasmide binario con un secondo T-DNA che trasportano il transgene. Quando il sito di infezione è in fusti o ipocotili, una pianta composita può essere ottenuta, con nuove radici transgeniche pelosi emergenti dai germogli di tipo selvaggio. In alternativa, pelosa radici trasformate possono crescere autonomamente in vitro nei media con ingressi sorgente di carbonio. L’uso di a. rhizogenes invece di a. tumefaciens per produrre tessuti transgenici sta guadagnando importanza quando la radice è l’organo bersaglio, perché pianta rigenerazione non è necessaria e quindi è più veloce e meno costoso. Gli studi precedenti hanno dimostrato questa metodologia ha stanziata per la caratterizzazione fenotipica di radice specifici geni^6,7,8,9.

La patata (Solanum tuberosum) è il quarto più importanti delle colture del mondo secondo la Food and Agriculture Organization delle Nazioni Unite (FAO) poiché il tubero ha rilevanza nutrizionale destinati al consumo umano per essere una buona fonte di vitamine e minerali. Per questo motivo, patata è stata posta sotto i riflettori di biotecnologia agricola e inoltre è considerata come un buon modello biologico per genetica ed evolutiva Studi^10,11. Trasformazione di patate ha contribuito significativamente alla comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti quali tessuti attraverso la caratterizzazione di geni coinvolti nella Suberina e cera biosintesi^{12,13,14 ,15,16,17}, Suberina monomero trasporto¹⁸ e trascrizione regolamento¹⁹. Il gene della transferasi feruloil suberina, FHT, è uno di questi geni biosintetici caratterizzati; la downregulation dà luogo ad un danno forte della protezione del periderma, che è correlata con una diminuzione forte in miscela di etanolo esteri di Suberina e cere di tuberi di patata¹⁴. In concomitanza, nelle radici e semi di Arabidopsis, il Ko di suo putativo ortologo (Massimo/RWP1) inoltre ha dimostrato suo ruolo nella produzione di alchil ferulates in suberina^20,21. Patata, la linea di transcriptional reporter FHT e l’anticorpo FHT hanno mostrato rispettivamente che l’attività del promotore e le proteine si trovano in exodermis, endodermis, i phellogen-derivati e in tessuti feriti¹⁵.

In questo lavoro, dettagliamo un protocollo utilizzando a. rhizogenes per produrre transgeniche radici pelosi che sono mantenute in un tiro di tipo selvaggio, generazione di piante di patate composito o asportato per crescere autonomamente in vitro. Forniamo anche il protocollo utilizza a. tumefaciens per ottenere piante di patate transgeniche completa. Come caso di studio, a. rhizogenes e a. tumefaciens trasformato con lo stesso vettore binario sono utilizzati per ottenere le radici con il promotore FHT Guida di espressione del gene reporter GUS . I risultati sono segnalati e rispetto.