Summary

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l’analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.

Abstract

L’applicazione di test di tossicità delle sostanze chimiche negli organismi superiori di ordine, come topi o ratti, è lungo e costoso, grazie alla loro lunga durata di vita e problemi di manutenzione. Al contrario, il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) presenta vantaggi per renderlo la scelta ideale per i test di tossicità: una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Qui, descriviamo un protocollo per la profilazione fenotipica automatica di c. elegans in una piastra 384 pozzetti. I vermi del nematode sono coltivati in una piastra 384 pozzetti con trattamento medio e chimico liquidi e video è presi di ciascun pozzetto per quantificare l’influenza chimica su 33 caratteristiche di verme. Risultati sperimentali dimostrano che le caratteristiche di fenotipo quantificati possono classificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stilare un elenco di priorità per ulteriori prove di valutazione di tossicità chimica tradizionale in un modello del roditore.

Introduction

Con il rapido sviluppo di composti chimici applicato alla produzione industriale e la vita quotidiana delle persone, è importante studiare la tossicità test di modelli per le sostanze chimiche. In molti casi, il modello animale roditore è impiegato per valutare la potenziale tossicità di diverse sostanze chimiche sulla salute. In generale, la determinazione delle concentrazioni letali (cioè, la dosati 50% dose letale [LD50] di diverse sostanze chimiche) è utilizzata come parametro tradizionale in un modello di roditore (ratto/topo) in vivo, che è molto costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della riduzione, affinare, o sostituire il principio di (3R) che è centrale per etica e sul benessere degli animali, nuovi metodi che consentono per la sostituzione degli animali superiori sono preziose per la ricerca scientifica1,2,3 . C. elegans è un nematode dissipato che è stato isolato dal suolo. È stato ampiamente utilizzato come un organismo di ricerca in laboratorio per le sue caratteristiche benefiche, come una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Inoltre, molte vie biologiche fondamentali, tra cui processi fisiologici di base e le risposte di sforzo in c. elegans, sono conservate nei più alti mammiferi4,5,6,7 , 8. in un paio di confronti noi ed altri abbiamo fatto, c’è una buona concordanza tra tossicità di c. elegans e tossicità osservati in roditori9. Tutto ciò fa di c. elegans un buon modello per testare gli effetti di tossicità chimica in vivo.

Recentemente, alcuni studi quantificato le caratteristiche fenotipiche di c. elegans. Le caratteristiche possono essere utilizzate per analizzare la tossicità dei prodotti chimici2,3,10 e l’invecchiamento dei vermi11. Abbiamo anche sviluppato un metodo che combina un verme liquido coltura sistema e un sistema di analisi di immagine, in cui i vermi sono coltivati in una piastra 384 pozzetti in diversi trattamenti chimici12. Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di c. elegans dopo 12-24h di trattamento chimico in una piastra 384 pozzetti con mezzo liquido. Una fase di microscopio automatizzato viene utilizzata per l’acquisizione dei video sperimentali. I video vengono elaborati da un programma di misura, e sono quantificati 33 caratteristiche relazionati al comportamento commovente ai vermi. Il metodo viene utilizzato per quantificare i fenotipi di vite senza fine nell’ambito del trattamento di 10 composti. I risultati mostrano che le diverse tossicità possono alterare i fenotipi di c. elegans. Questi fenotipi quantificati possono essere utilizzati per identificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare l’osservazione e la quantificazione fenotipica degli esperimenti con c. elegans in una coltura liquida. Questo metodo è utile per l’applicazione di c. elegans in valutazioni di tossicità chimica e quantificazioni di fenotipo, che aiutano a prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stabilire una lista di priorità per ulteriori tradizionale test di valutazione di tossicità chimica in un modello del roditore. Inoltre, questo metodo può essere applicato alla tossicità di screening e test di nuove sostanze chimiche o il composto come l’inquinamento agente additivo alimentare, composti farmaceutici, composti esogeni ambientali e così via.

Protocol

Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del Comitato di etica animale del centro di Pechino per la prevenzione e il controllo in Cina. 1. preparazione chimica Ottenere prodotti chimici (tabella 1 e Tabella materiali). Determinare il dosaggio più alto e più basso dei singoli prodotti chimici per una concentrazione minima di 100% letalità (LC100, 24 h) e una concentrazione massima del 100% nonlethality (LC0, 24 h) alle vit…

Representative Results

Abbiamo testato i fenotipi di vermi esposti a diverse concentrazioni di più di 10 prodotti chimici12. Nel test, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per ogni composto a tre intervalli di tempo (h 0, 12h e 24h) chimico. In precedenza, un confronto tra un manuale e un’analisi automatica di un test di durata della vita è stato fatto11,12. In questa analisi, abbiamo trovato che prodotti chimici…

Discussion

I vantaggi di c. elegans hanno portato al suo utilizzo crescente in tossicologia9, sia per studi meccanicistici e approcci di screening ad alta resa. Un ruolo maggiore per c. elegans nell’integrare altri sistemi di modello nella ricerca tossicologica è stato notevole negli ultimi anni, soprattutto per la valutazione della tossicità rapida di nuove sostanze chimiche. Questo articolo fornisce una nuova analisi di screening ad alta resa, quantitativa del worm fenotipi in una piast…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano CGC per gentilmente inviare il c. elegans. Questo lavoro è stato supportato da nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina Grant (#31401025, #81273108, #81641184), capitale salute ricerca e sviluppo di un progetto speciale a Pechino (#2011-1013-03), il fondo di apertura del laboratorio di tossicologia ambientale (# chiave Beijing 2015HJDL03) e la Fondazione di scienze naturali della provincia di Shandong, Cina (ZR2017BF041).

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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