Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için
Summary
Nicel bir yöntem tanımlamak ve fenotipik Caenorhabditis elegansprofil oluşturma otomatik olarak analiz ederek kimyasal maddeler akut toksisite tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı, bir 384-şey tabak içinde solucanlar kimyasallar ile tedavi, video esir alma ve toksikolojik ilgili fenotipleri ölçmek açıklar.
Abstract
Fare ya da sıçan, gibi daha yüksek sipariş organizmalarda kimyasal maddelerin toksisite test uygulama zaman alıcı ve pahalı, uzun ömrü ve bakım sorunları nedeniyle. Aksine, Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) toksisite testleri için ideal bir seçim yapmak için avantajları vardır: kısa ömrü, kolay ekimi ve verimli üreme. Burada, otomatik fenotipik C. elegans 384-şey tabak içinde profili için bir protokol açıklayın. Yuvarlak solucanlar bir 384-şey plaka sıvı orta ve kimyasal tedavi ile kültürlü ve videolar 33 solucan özellikleri kimyasal etkisi ölçmek için her iyi alınır. Deneysel sonuçlar quantified fenotip özellikler sınıflandırmak ve akut toksisite farklı kimyasal bileşikler için tahmin ve kemirgen bir modelinde daha fazla geleneksel kimyasal toksisitesi değerlendirme sınamaları için bir öncelik listesi kurmak olduğunu göstermek.
Introduction
Sanayi üretimi ve insanların günlük yaşam için uygulanan kimyasal bileşikler hızla gelişmesi ile birlikte, sınama modelleri kimyasallar için toksisite eğitim önemlidir. Birçok durumda, kemirgen hayvan modeli farklı kimyasallar sağlığı üzerinde potansiyel toksisitesi değerlendirmek için istihdam edilmektedir. Genel olarak, öldürücü konsantrasyonları (yani, bölümü % 50 öldürücü doz [LD50] farklı kimyasallar) belirlenmesi içinde vivo bir kemirgen (fare/fare) modelinde geleneksel parametre olarak zaman alıcı ve pahalı olan kullanılır. Buna ek olarak, küçültme nedeniyle iyileştirmek veya yerine hayvan refahı ve etik merkezi bir noktada bulunuyor (3R) prensibi, yüksek hayvanlar değiştirilmesi için bilimsel araştırma1,2,3 ‘ e değerli sağlayan yeni yöntemler . C. elegans topraktan izole edildikten evrimleşmiş bir yuvarlak solucanlar var. Bu yaygın olarak laboratuvar araştırma organizmada kısa ömrü, kolay ekimi ve verimli üreme gibi yararlı özellikleri nedeniyle kullanılmıştır. Buna ek olarak, temel fizyolojik süreçleri ve stres yanıt C. elegans, içinde de dahil olmak üzere birçok temel biyolojik yollar daha yüksek memeliler4,5,6,7 ‘ konservasyonu , 8. biz ve diğerleri yapmış karşılaştırmalar bir çift olarak, C. elegans toksisite ve kemirgenler9‘ gözlenen toksisite arasında iyi bir uyum olduğunu. Tüm bu kimyasal toksisitesine içinde vivo etkilerini test etmek için iyi bir model C. elegans yapar.
Son zamanlarda, bazı çalışmalarda C. elegansfenotipik özellikleri sayılabilir. Özellikleri kimyasal2,3,10 toksisite ve solucanlar11yaşlanma analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca sistem ve solucanlar bir 384-şey plaka farklı kimyasal tedaviler12altında kültürlü bir görüntü analiz sistemi sıvı solucan birleştiren bir yöntem geliştirdi. Nicel bu teknik sonra 12-24 h sıvı orta ile 384-şey plaka kimyasal tedavi C. elegans 33 parametrelerini otomatik olarak analiz etmek için geliştirilmiştir. Bir otomatik mikroskop sahne deneysel video satın alma için kullanılır. Video özel olarak tasarlanmış bir program tarafından işlenir ve solucanlar hareketli davranış için ilgili 33 özellikleri sayılabilir. Solucan fenotipleri 10 bileşiklerin tedavi altında ölçmek için kullanılan yöntem. Sonuçlar farklı toksisitesine C. elegansfenotipleri değiştirebilir gösterir. Bu quantified fenotipleri tanımlamak ve farklı kimyasal bileşikler akut toksisite tahmin etmek için kullanılabilir. Bu yöntem genel amacı gözlem ve fenotipik miktar sıvı kültüründe C. elegans ile deneyler kolaylaştırmaktır. C. elegans uygulama kimyasal toksisitesi değerlendirme ve farklı kimyasal bileşikler akut toksisite tahmin ve için bir öncelik listesi kurmak yardımcı fenotip quantifications için bu yöntem yararlıdır daha fazla geleneksel kimyasal toksisitesi değerlendirme sınamaları kemirgen bir modeldir. Buna ek olarak, bu yöntem tarama ve yeni kimyasal madde veya bileşik Gıda katkı maddesi Ajan kirliliği, pharmacautical bileşikleri, çevre eksojen bileşik ve benzeri test toksisite için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans avantajları artan kullanımı toksikoloji9, hem mekanik çalışmalar ve yüksek üretilen iş tarama yaklaşımlar yol açmıştır. Toksikolojik araştırmalar diğer modeli sistemlerinde tamamlayan artan bir rol C. elegans için son yıllarda, özellikle yeni kimyasallar hızlı toksisitesinin değerlendirilmesi için dikkat çekici olmuştur. Bu makalede solucan yüksek üretilen iş, nicel tarama yeni bir tahlil fenotipleri 384-şey plaka otomatik tanımlama ve k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar CGC nazikçe C. elegans gönderdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) tarafından desteklenmiştir Ulusal Doğa Bilimleri Çin Grant (#31401025, #81641184 #81273108), sermaye Sağlık Araştırma ve geliştirme Pekin (#2011-1013-03), Çevresel Toksikoloji (# Beijing anahtar laboratuvar açılış Fonu’nun özel projesinin temeli 2015HJDL03) ve doğal Bilim Vakfı, Shandong Eyaleti, Çin (ZR2017BF041).
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
Riferimenti
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
