Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo – y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.
Tráfico de receptores a y desde la superficie de la célula postsináptico es un mecanismo importante por el cual las neuronas modulan su respuesta a diversos estímulos. Los receptores (AMPA) ácidos α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico, que son responsables de la transmisión sináptica excitadora rápida en las neuronas, son traficados hacia y desde la superficie postsináptica para modificar dinámicamente la excitabilidad neuronal. AMPA del receptor es esencial para la plasticidad sináptica y puede interrumpirse en enfermedad neurológica. Sin embargo, prevalecen enfoques para la cuantificación del receptor de tráfico ignoran piscinas todo receptor, son demasiado tiempo – y mano de obra intensiva, o potencialmente interrumpir los mecanismos normales de tráfico y por lo tanto complicar la interpretación de los datos resultantes. Presentamos un análisis de alto contenido para la cuantificación de las poblaciones de receptores AMPA tanto superficiales como internas en las neuronas hipocampales primarias cultivadas usando doble inmunomarcación fluorescente y un analizador de infrarrojo cercano microplacas de 96 pocillos fluorescentes. Este enfoque facilita la rápida proyección de bulto internalizado y las densidades del receptor de la superficie y reducir al mínimo el material de la muestra. Sin embargo, nuestro método tiene limitaciones en la obtención de resolución unicelular o realizar proyección de imagen de células vivas. Por último, este protocolo puede ser susceptible a otros receptores y diferentes tipos de células, proporcionados optimización y ajustes correspondientes.
La magnitud y la dinámica temporal de la excitabilidad neuronal depende en gran medida la disponibilidad y composición de las poblaciones de superficie receptores que transducen señales electroquímicas. Mientras que la síntesis de nuevos receptores (o subunidades del receptor) es generalmente un proceso enérgio costoso y relativamente prolongado, una serie de maquinaria celular dedicada a la endo – y exocitosis de los receptores existentes proporcionan un medio para su rápida inserción y a y desde la membrana1. Por lo tanto, además de la regulación transcripcional y traduccional de receptores, receptores posttranslational trata es un importante modulador de la excitabilidad neuronal.
La plasticidad sináptica, o la fuerza cambiante de las conexiones entre las neuronas con experiencia, se cree que forman la base del aprendizaje y la memoria2,3. El fortalecimiento y debilitamiento de las sinapsis con el tiempo, denominadas potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD), respectivamente, se pueden modular mediante el tráfico de receptores del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) 4 , 5. los receptores AMPA son heterotetramers compuesta de cuatro subunidades (GluA1-4) y median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora rápida en el cerebro6. Así, la excitabilidad de la neurona es en gran parte una función de la cantidad de receptores AMPA en la superficie postsináptica disponible para ser activado por el glutamato. LTD es comúnmente asociado con un aumento en la endocitosis del receptor AMPA, mientras que LTP está predominantemente asociada con un aumento en la exocitosis del receptor AMPA. Expresión superficial postsináptica de los receptores AMPA requiere entrega endosomal exocitóticas proteínas, donde se produce la fusión con la membrana plasmática luego en una forma dependiente de calcio7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. también existen una serie de mecanismos que regulan la endocitosis de receptores AMPA dependiente de actividad. Un ejemplo de esto es a través del gene temprano inmediato del arco/Arg3.1 (Arc). Entre otras funciones15, arco se sabe para mediar receptores de glutamato metabotrópicos (mGluR)-LTD dependiente promoviendo la endocitosis del receptor AMPA a través de sus socios de la Unión, que incluyen proteínas endocíticas AP-2, endophilin 3 y Dinamina-2 16 , 17 , 18 , 19, en el revestimiento de clatrina pozos de20,21. Receptores AMPA internalizados pueden reciclados hacia la membrana plasmática o destinados a la degradación22,23.
Lo importante es la composición de la subunidad de los receptores AMPA contribuye a su tráfico dinámica24. De gran relevancia es el dominio c-terminal intracelular de las subunidades, donde ocurre la mayoría de modificaciones del posttranslational y las interacciones de la proteína relacionada con la trata de personas. GluA1 y GluA4 que contienen la subunidad los receptores AMPA son particularmente aptos para trata a la superficie de la célula durante la LTP, en parte debido a la presencia de los ligandos de la PDZ, ~ 90 secuencias de aminoácidos que promueven la membrana anclaje mediante interacciones con varios PDZ dominio-que contienen proteínas25,26. Por otro lado, los receptores de AMPA que contiene GluA2 y falta de GluA1 o GluA4 tienden a ser traficados constitutivamente pero acumulan intracelular con actividad sináptica27. Subunidades GluA2 someterse a RNA de edición que, además de favorecer la retención en el retículo endoplásmico28, hace que el poro del canal impermeable al calcio29, implicando más específicos de la subunidad se trata como un mediador clave de neuronal homeostasis y plasticidad. Curiosamente, la interrupción de la degradación de arco dependiente de ubiquitina se ha demostrado que GluA1 endocitosis e incrementar la expresión superficial de GluA2 subunidad que contiene los receptores AMPA después de inducción de mGluR LTD con el selectivo agonista mGluR del grupo I (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), lo que indica que queda mucho por aprender sobre los mecanismos y el papel de la subunidad específica AMPA receptor tráfico30.
Métodos para la observación de cambios en la expresión de los receptores de la superficie son a menudo engorrosos, lentos, o introducir innecesarios confunde. Ensayos de biotina son un enfoque generalizado y disponible comercialmente. Purificación de la afinidad de receptores de superficie biotinilado representa un ejemplo de ello, sin embargo la necesidad de realizar electroforesis requiere una gran cantidad de material de la muestra y puede representar la proyección de múltiples tratamientos prohibitivamente largos proceso31. Extensiones de este ensayo, donde varios puntos de tiempo de etiquetado y immunoprecipitations se realizan para cuantificar la degradación gradual de una señal inicial, del mismo modo descuidan la adición de nuevo — o reciclado, receptores para la célula superficial y sólo exacerban el tiempo y requerimientos de materiales.
Otros enfoques de hacen uso de construcciones quiméricas o la adición de etiquetas fluorescentes para observar el tráfico del receptor32, usando a veces vivo celular imagen33,34. Mientras que potencialmente de gran alcance, estos diseños pueden afectar los patrones de tráfico normales de los receptores debido a las mutaciones o cambios dramáticos en peso molecular introducido en estas proteínas. El uso de tintes que compartimientos subcelulares etiqueta dirigiéndose a pH bajo34,35 son inespecíficos y distinguir entre diferentes compartimentos intracelulares importantes para el receptor trata de personas (por ejemplo. lisosomas y proteasomas) difícil. Por último, el uso de la microscopia confocal para visualizar la colocalización de receptores con marcadores relacionados con la trata de personas y la degradación, como clatrina, proteínas endosomal mientras que potencialmente proporciona una visión útil localización específica con resolución subcelular, tiempo, mano de obra intensiva y costosa debido a la necesidad de analizar individualmente cada celda y el requisito de confocal o microscopia de la estupendo-resolución.
Aquí, demostramos un análisis tráfico alto contenido del receptor que es compatible con las preparaciones de cultivo neuronal primario30. Este método etiquetas por separado de las piscinas de superficie e intracelular receptor de neuronas fijadas, lo que permite la presentación de datos como una proporción de superficie normalizada o densidad del receptor internalizada a la densidad general para que el receptor. La naturaleza de alto contenido de este método es ideal para la detección de múltiples tratamientos o genotipos en un corto plazo y requiere experiencia en incubación cultivo y anti-célula estándar.
Brevemente, las neuronas primarias son crecidas en microplacas de 96 pocillos estándar tratadas según diseño experimental, se incubaron con anticuerpos primarios, lavadas y fijo. Las células entonces se incuban con un anticuerpo secundario a receptores de la superficie, seguidos por otro paso de fijación de la etiqueta. Permeabilización entonces ocurre y un segundo anticuerpo secundario se utiliza para etiquetar piscinas del receptor interno. Finalmente, las células son imágenes usando un lector de microplacas fluorescente infrarrojo para cuantificar la densidad integrada de cada población del receptor. Figura 1 resume nuestro análisis de alto contenido en comparación con un ensayo de Biotinilación tradicional.
Mientras el protocolo ofrece aquí es específico para el receptor de AMPA trata de culturas primarias neuronas hippocampal y optimizado, este procedimiento podría, en teoría, es ampliado y adaptado para diversos receptores en una variedad de tipos celulares.
Los receptores AMPA son un subtipo de receptores de glutamato ionotrópicos que es esencial para las funciones neuronales que incluyen formación de sinapsis, la sinapsis estabilidad y plasticidad sináptica. Alteración del receptor AMPA está vinculado a múltiples trastornos neurológicos24 y se consideran drogas atractivos objetivos40. Por ejemplo, estudios han demostrado que una de las muestras más tempranas de la enfermedad de Alzheimer (EA) es la pérdida de sinapsis y reducido sináptica niveles del receptor AMPA de41,42. Curiosamente, además de los oligómeros de amiloide-ß deteriora la expresión del receptor AMPA que contiene GluA1 de superficie en sinapsis43. Además, del estado de abajo-regula la GluA2 mRNA y proteína en las neuronas hipocampales anterior a su muerte44. En la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), alquitrán de ADN proteína (TDP-43) patología, una anormalidad molecular específica de ALS, ha estado vinculado a ineficiente sitio de GluA2 Q/R-RNA editando45.
El ensayo trata de alto contenido AMPA receptor proporciona un medio eficaz para medir cambios a granel en perfiles tráfico del receptor dentro de una red neuronal en respuesta a diversos factores, consumiendo mucho menos tiempo y materiales que los métodos alternativos. Una sola microplaca de 96 pocillos proporciona numerosos pozos para ejecutar técnicas múltiples replica y controles para diferentes condiciones experimentales en el mismo plato. La densidad de baja placas de 2 x 104 células/pozo en relación con la densidad de 5 x 105 células/pozo reduce significativamente el número de animales y materiales necesarios para cada experimento (figura 1). El escáner de infrarrojos puede imagen microplacas de 96 pocillos hasta seis a la vez. El ensayo también puede modificarse para microplacas de 384 pozos46, que se convierte en especialmente valiosa si el ensayo se ejecuta en las muestras preciosas que son difíciles de conseguir o son caros a la cultura (muestras por ejemplo humano y células madre pluripotentes inducidas). El ensayo completo puede ser terminado y analizado el mismo día, lo que ahorra tiempo (figura 1).
Para la terminación exitosa y eficiente de la prueba, algunos puntos deben ser considerados. En primer lugar, es importante preparar la solución DHPG en el mismo día del tratamiento de la neurona. No reutilizar ni congelar existencias DHPG. El 4% paraformaldehyde/4% de sacarosa en solución de PBS debe también hacerse fresca el mismo día del experimento. En segundo lugar, pocillos de control trataron con TTX solo o vehículo están obligados a garantizar que los efectos observados son específicos de tratamiento. También es fundamental incluir pozos tratados con sólo los anticuerpos secundarios para control por fluorescencia del fondo producida por fijación no específica. Tenga en cuenta que el segundo paso de la fijación (siguiente lavado de anticuerpos secundarios) es clave para reducir efectos de fondo del anticuerpo secundario y lograr un etiquetado eficaz de subunidades del receptor.
Compromisos y limitaciones, como con cualquier método, existen. Este análisis no proveen resolución unicelular (o subcelular) y no permiten el seguimiento en tiempo real del receptor trata como otros métodos32,33,35. Además, adecuado debe tenerse cuidado durante el paso de permeabilización de las neuronas, como este método será sensible a la filtración de componentes intracelulares en el caso de exceso de permeabilización.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Zachary Allen para asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Whitehall (concesión 2017-05-35) y Cleon C. Arrington investigación beca programa de iniciación (RIG-93) a a.m.m. M.A.G. y D.W.Y. fueron apoyados por una beca de 2CI Neurogenomics de Universidad de estado de Georgia.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |