AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージア州立大学によって承認されています。 1. (層流フード) で第一次海馬ニューロンの準備 分離混合セックス生後 (P) から一次海馬ニューロン 0 136前述したようにマウス。 96 ウェル ポリ-D-リジン プレート ニューロンは、ウェルあたり 2 x 10 の4セルの密度でマイクロ プレートをコーティングしました。 50 の 10 mL を追加することによって、ニューロンを供給するためのメディアの準備 B-27、グルタミン x 100 の 5 mL, 10 mg/mL 5-フルオロ-2 ‘-デオキシウリジン (FUDR) の 242 μ L と 10 x μ L 485 mL 神経メディア (材料の表を参照してください) にゲンタマイシンを 10 mg/mL の。 フィード ニューロン前述36半分を削除することによって (100 μ L) 各ウェルから既存メディア (神経細胞の生存をサポートする成分が含まれているエアコンのメディアと呼ばれる) と 37 ° C の 100 μ L で交換の prewarmed メディア手順 1.3 の準備すべての 3-4 日。ステップ 2.3 の 4˚C でそれぞれの餌からエアコンのメディアを格納します。 2. 人身売買 (層流フード) で DHPG への応答で AMPA 受容体の測定 一日で体外 (DIV) 14、準備細胞培養を使用して 2 mM の濃度で 500 μ L 在庫ソリューション テトロドトキシン (TTX) のグレードの水。注意:TTX は神経毒です。慎重に扱うし、皮膚との接触を避けてください。 マルチ チャンネル ピペットを使用すると、ニューロンの 96 ウェル マイクロ プレートの各ウェルから 100 μ L を削除し、メディアをプールします。 TTX の 4 μ M 溶液を作成する 2.2 の段階からプールされた調節されたメディアの 1 mL に TTX ストック溶液 2 μ L を追加します。十分なプール付きのメディアが存在しない場合は、手順 1.4 からストアド エアコン メディアのいくつかを使用します。 ステップ 2.3 から TTX の 4 μ M 溶液 100 μ L/ウェル ニューロンを扱います。4 h の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターでマイクロ プレートを配置します。 パスツール ピペットのサクション ラインに、ピペットの先端を滅菌 200 μ L ピペット片方滅菌ガラスを取り付けます。まあ慎重にそれぞれからメディアを削除します。ニューロンがあるマイクロ プレートの底に触れないでください。 各ウェルに室温神経メディアの 200 μ L を追加します。 15 分インキュベーション 5% CO2が望ましいですが、必須ではありませんは、室温でマイクロ プレートを孵化させなさい。 3. Immunolabelling (層流フード) で 神経のメディアにおける反 GluA1 または抗 GluA2 抗体の 1: 150 希釈を準備します。 ステップ 2.6 で追加された神経のメディアを削除します。抗体の結合を許可する室温で 20 分間対応する井戸に反 GluA1 または抗 GluA2 抗体溶液の 50 μ L を追加します。二次抗体のみ制御井戸に神経メディアの 50 μ L を追加します。 3.2 の手順で追加抗体ソリューションを削除します。任意の非連結の抗体を除去するため 100 μ L/ウェル室温神経メディアで 3 回マイクロ プレートを洗います。 神経のメディアや細胞培養グレードの水 DHPG の 50 mM の原液を作る。渦簡潔に、DHPG を完全に解消するソリューション。実験の同じ日にこのソリューションの新鮮なを準備します。古いまたは解凍ソリューションを使用しないでください。 1: 500 100 μ M の解決をするために神経のメディアで原液を希釈します。 各ウェルから既存のメディアを削除します。ステップ 3.5 から 100 μ M DHPG 原液の 100 μ L/ウェルを追加します。マイクロ プレート 5% CO2の 37 ° C で 10 分間のインキュベーターで孵化させなさい。 3.6 の手順で追加 DHPG ソリューションを削除し、100 μ L/ウェル神経メディアを追加します。この手順をあと 1 回繰り返します。5% CO2の 37 ° C で 5 分間のインキュベーターでマイクロ プレートを配置します。 実験の同じ日に PBS で 4 %paraformaldehyde/4% スクロース溶液にショ糖を追加します。古いまたは解凍ソリューションを使用しないでください。3.7 の手順で追加メディアを削除します。4 %paraformaldehyde/4% ショ糖溶液 100 μ L/ウェルを追加します。追加時期ごとに、手順 3.6-3.8.完了すると、20 分のための 4 ° C でマイクロ プレートを孵化させなさい。注意:ヒューム フードのパラホルムアルデヒド株式を処理します。 ステップ 3.8 から定着剤を削除し、100 μ L/ウェルの冷たい 1 x DPBS を追加します。 DPBS を削除します。追加 150 μ L/ウェル バッファー (TBS で使用する準備ができての定式化は材料表を参照) をブロックまたは 90 分間室温でインキュベート、4 ° C で一晩インキュベート 4. 表面の受容器のラベル 680RD ヤギの抗マウス IgG の抗体のブロック バッファー内の 1:1500 希釈を準備します。 3.10 のステップからのブロック バッファーを削除します。二次抗体溶液 50 μ L/ウェルを加えて 60 分続ける二次抗体を追加したら、光から保護されているマイクロ プレートは室温で孵化させなさい。その後孵化中に光からマイクロ プレートを保護するために継続することを確認します。 4.2 のステップからソリューションを削除します。100 μ L/ウェル TBS (50 mM トリス-HCl、150 mM の NaCl、pH 7.6) を追加し、5 分は、この手順を繰り返します 4 追加の時間のために、室温でインキュベートします。 4.3 のステップから TBS を削除します。PBS で 4 %paraformaldehyde/4% ショ糖の 100 μ L/ウェルを追加し、15 分間室温でインキュベートします。 4.4 ステップからソリューションを削除します。100 μ L/ウェル TBS を追加し、5 分繰り返しこの手順 2 の追加時間の室温でインキュベートします。 5. 内面化された受容体人口のラベリング 0.2% サポニンを含む TBS を準備します。渦サポニン粉末を完全に溶解を簡単に解決します。自動蛍光を引き起こす可能性のある粒子を除去する 0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。 150 μ l 添加 TBS 0.2% サポニンを含むと 15 分間室温でインキュベートします。 サポニンのソリューション ステップ 5.2 から削除し、150 μ L/ウェル ブロック バッファーを追加します。90 分間室温でインキュベートします。 800CW ロバ抗マウス igg 抗体二次抗体ブロッキング バッファー内の 1:1500 希釈を準備します。 ステップ 5.3 からブロック バッファーを削除し、二次抗体溶液 50 μ L/ウェルを追加します。60 分間室温でインキュベートします。 100 μ L/ウェル TBS を追加し、5 分繰り返しこの手順 4 の追加時間の室温でインキュベートします。 6. 画像処理と解析 製造元の指示に従ってシステムをイメージング赤外線レーザを用いた 96-well マイクロ プレートをイメージします。84 μ m、媒体、フォーカスを 96 ウェル マイクロ プレート使用の基準の高さによるとオフセット スキャン品質のスキャン解像度を設定します。「イメージ スタジオ」メニュー ボタン → をクリックしてエクスポート → TIFF 形式で、300 dpi の解像度でデジタル メディア → エクスポート画像のイメージ。 Https://imagej.net/Fiji/Downloads でイメージ J「フィジー」をダウンロードします。 画像 J「フィジー」で画像を開く。「イメージ」メニューをクリックしてしてカラー チャンネルを分割色 → チャンネルの分割。 「分析」→「ツール」から ROI マネージャーを開きます。数字とサークルをラベルする ROI マネージャーで「ラベル」ボックスを確認します。 赤のチャネル (680 nm 表面受容体プール) で、[円] ツールを選択し、最初の井戸を正確に収まる円を描いて、関心領域 (ROI) を選択します。Ctrl キーを押しながら T キーを押します。 まあ次の円をドラッグし、Ctrl + t. 繰り返しを押してすべての井戸が囲んでいます。 ROI マネージャーから「メジャー」をクリックします。表示され、スプレッドシートにコピーする値を選択します。 グリーン チャンネル (800 nm 受容体の内部プール) をクリックし、イメージに手順 6.6 から選択した Roi を転置します。ROI マネージャーから「メジャー」をクリックします。表示され、スプレッドシートにコピーする値を選択します。 井戸を制御するだけセカンダリから統合された密度の平均値を計算します。表面受容体プールの平均のセカンダリのみ統合制御の密度の値から各実験も統合密度値を減算します。内部の受容体プールのこの手順を繰り返します。 Rの/RtRsは、表面の受容器の集積密度を表す Rtを表す表面の受容器の集積密度 + の集積密度を用いた表面受容体発現の変化を計算します。内部の受容体。