Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.
En hücresel belirli bir gen programları transkripsiyon modülasyon tarafından düzenlenmektedir. Böyle modülasyon transkripsiyon faktörleri (TFs) ve transkripsiyon harekete geçirmek ya da baskı yoluyla kromatin yapısı değişimler arabuluculuk Kofaktörler geniş bir Birleşik eylemler yoluyla elde edilir. Histon değişiklikler eşleme ve transkripsiyon faktörleri/Kofaktörler DNA için bağlama profil oluşturma, böylece bir anlık görüntüsünü farklı sırasında meydana gelen dinamik nükleer değişiklikleri sağlamak için yararlı moleküler biyoloji yaklaşım kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu biyolojik süreçleri.
Yağ dokusu transkripsiyon Yönetmelikte çalışmaya, vitro hücre kültürleri türetilmiş örnekleri ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları kez çip deneyleri içinde malzeme başlayan bereket nedeniyle tercih ve biyolojik değişkenlik azaltılmış. Ancak, bu modeller canlı organizmalar gerçek kromatin durumda sınırlı bir kesitini temsil eder. Böylece, hayvan modellerden elde edilen yağ doku örnekleri üzerinde çip gerçekleştirmek en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada bir iletişim kuralı için verimli ChIP-seq histon modifikasyonları ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) bir fareden izole olmayan histon proteinleri, açıklayın. Protokol genom çapında yerelleştirme faiz ve yağ depoları arasında morfolojik ve fizyolojik olarak ayrı bir dokudur yarasa epigenetik işaretleyicilerini proteinlerin soruşturma için optimize edilmiştir.
Beyaz Yağ dokusundan (WAT) enerji depolama için uzman iken, kahverengi yağ dokusundan (BAT) karbonhidratlar ve yağlar termal enerji ile mitokondrial uncoupling1dönüştürmek için onun yetenek nedeniyle ısı formunda enerji kalır. Bu özel işlevi nedeniyle yarasa Depo bakımı vücut ısısı fizyolojik koşullarda ve yanıt-e doğru soğuk pozlama için gereklidir. Gen ifade değişiklikleri sırasında yarasa farklılaşma ve termojenik stres üzerine kapsamlı bir şekilde içinde vivo ve tüp bebek incelenmiştir, bu değişiklikler temel moleküler mekanizmaları çoğunlukla disseke ölümsüzleştirdi hücre hatlarında ve birincil edilmiş öncesi adipositler, birkaç içinde vivo çalışmalar2,3,4,5dışında.
Düzenleme, belirli bir gen ifade transkripsiyon düzenleme programlarını koordine değişiklikleri çeşitli transkripsiyon faktörleri ve ortak eylemler faktörler kromatin yapısı ile elde edilir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP), işe alım için DNA bu faktörlerin araştırılması ve kromatin manzara ilişkili değişimler profil oluşturma için bir değerli moleküler biyoloji yaklaşımdır. ChIP deneyler başarısı için önemli faktörler crosslinking koşullar ve farklı örnekleri, boyunca kromatin kesme tutarlılık yeterli Başlangıç materyali ve en önemlisi, antikorlar kalitesini en iyi duruma getirmeleri içerir. ChIP bütün dokulardan gerçekleştirirken, heterojen örnekleri göz önünde bulundurun ve çekirdekleri yalıtım verimliliğini artırmak için iletişim kuralı en iyi duruma getirmek önemlidir, ikincisi ile özellikle hassas bir adım olması nedeniyle yağ dokusu ile çalışırken yükseltilmiş lipid içerik. Aslında, tüm yağ depoları moleküler yalıtım teknikleri trigliserid düzeyi yüksek varlığı ile karmaşık ve protokolleri kromatin yalıtım miktarını artırmak için optimize edilmiş olması gerekir. Yüksek işlem hacmi sıralama sonra ChIP-DNA izolasyon gerçekleştirildiğinde, son olarak, sıralama derinlik güvenle algılanır doruklarına sayısını belirlemek için önemlidir.
Burada, biz çalışma standartları ve kodla ve modENCODE konsorsiyumlar6 için en iyi yöntemler tarafından önerilen ChIP-seq deneyler için genel kurallar bakın ve ChIP-seq yarasa üzerinden için optimize edilmiş bir protokol, adım adım açıklamasını odaklanmak. DNA’ya bağlanıcı faktörler iyi tanımlanmış zirveleri ile hem de histon işaretleri kapatıyor sinyalleri ile genom çapındaki sıralama gerçekleştirmek için açıklanan protokol kromatin Yağ dokusundan verimli izolasyon sağlar.
Burada açıklanan protokolü üzerinden fare dokular, özellikle kahverengi yağ dokusu için en iyi duruma getirilmiş ChIP yerine getirmek için değerli bir araç temsil eder. Hücreleri yeterli sayıda numune hazırlama sırasında yapılan çip dokudan işlemlerinde büyük zorluklardan biri kurtarıyor. SOPAYI önemli ölçüde paslanmaz çelik boncuk yerine bir kanonik cam havaneli ile birleştiğinde bir doku homogenizer blender kullanarak kesme kırılmamış doku nedeniyle kayıp hücre sayısını azaltır. A…
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
HiSeq 2000 | Illumina |