マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降
Summary
ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ) のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、ヒストン修飾のマッピングとゲノムワイド興味の生体内の非ヒストン蛋白質のローカリゼーションを調査の両方に適しています。
Abstract
ほとんどの携帯電話のプロセスは、プログラム特定の遺伝子の転写調節によって規制されています。このような変調は、幅広い転写因子 (TFs) と転写活性化とクロマチン構造の変化を介して抑制を仲介する因子の結合されたアクションによって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) はヒストン修飾のマッピングと DNA 結合転写因子/補因子をプロファイリング、従って異なった時に発生する動的核変化のスナップショットを提供するための便利な分子生物学的アプローチ生物学的プロセス。
脂肪組織における転写制御を勉強するサンプルの培養細胞培養由来の不死化または一次電池線出発材料が豊富なのために、しばしばチップ試金で好まれている、生物学的変動を低減します。しかし、これらのモデルは、生物における実際のクロマチンの状態の限られたスナップショットを表します。従って、動物モデルから派生した脂肪組織サンプルでチップを実行する最適化されたプロトコルの重要な必要性があります。
ここでのヒストンの修正および褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離された非ヒストン蛋白質の効率的なチップ seq のプロトコルについて述べる。プロトコルは、ゲノムの関心と脂肪質のターミナルの間で形態学的および生理学的に明瞭な組織であるバットのエピジェネティックな遺伝子マーカー蛋白質のローカリゼーションを調査するために最適化されています。
Introduction
一方、白色脂肪組織 (WAT)、エネルギー貯蔵に特化して、褐色脂肪組織 (BAT) は熱エネルギーを介してミトコンドリア脱共役1炭水化物や脂質に変換されることにより熱の形でエネルギーを散らします。この専門にされた機能に応じて、バット デポは体温寒冷暴露、生理的条件でのメンテナンスが必要です。不死化細胞株で切り裂かれたと主なこれらの変更の基礎となる分子機構はほとんどされている遺伝子発現変動バット分化と熱応力は、生体内および生体外で広く研究されている、しながら前脂肪細胞は、いくつかの生体内研究2,3,4,5を除いて。
転写調節を介して特定の遺伝子発現プログラムの規制は、クロマチン構造を介して様々 な転写因子し、共同行動を要因に協調的な変更によって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、DNA にこれらの要因の募集を調査するため、関連するクロマチン景観変化のプロファイリング貴重な分子生物学的アプローチです。チップの実験の成功の重要な要因には、架橋条件とクロマチン異なるサンプル全体にせん断の一貫性、適切な開始材料と、最も特に、抗体の品質の可用性の最適化が含まれます。チップを実行すると全体の組織から、また、サンプルの不均一性を考慮し、核分離の効率を改善するためにプロトコルを最適化することが重要だ、後者特に機密性の高いステップのために脂肪組織を操作するとき高脂質内容。実際には、全体脂肪デポから分子の分離技術は、トリグリセリドの高いレベルの存在によって複雑なし、クロマチン分離の量増やすにはプロトコルに最適化しなければなりません。最後に、チップ DNA の隔離後高スループット シーケンスを実行すると、シーケンス処理深さは自信を持って検出されたピークの数を決定する重要です。
ここでは、作業標準とベスト プラクティスについては、エンコードと modENCODE するためのコンソーシアム6推奨チップ seq 実験のための一般的なガイドラインを参照してください我々 と我々 はバットからチップ seq に最適化されるプロトコルの手順説明に焦点を当てます。記述されていたプロトコルは、脂肪組織からクロマチンの効率的な分離、拡散信号とヒストンと同様、明確に定義されたピークを持つ DNA 結合因子のゲノム シーケンスを実行するには
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明されているプロトコルは、マウス組織、褐色脂肪組織用に最適化されたからチップを実行するための貴重なツールを表します。組織からチップを実行する大きな課題の 1 つはサンプル準備の間十分な細胞数を回復します。標準ガラス杵ではなくステンレス ビーズと相まって大幅組織ホモジナイザー ミキサーを使用してバットをせん断切れ目のない組織のため失われた細胞の数が?…
Materials
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
Riferimenti
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