Summary

Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.

Abstract

La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.

Introduction

En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación3. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano4,5.

Además, muestras humanas comúnmente son procesadas y anotó por las instalaciones del núcleo de histopatología y patólogos experimentados humanos a través de estandardizado métodos y criterios histopatológicos. Por el contrario, tejidos murinos son generalmente fijos, incrustados y analizados por los investigadores con experiencia limitada de protocolos histopatológicos. La calidad y fiabilidad de la examinación histopatológica comienza con la preparación de las secciones de tejido de alta calidad. Varios factores contribuyen críticamente al aumento o disminución de la calidad de definitiva, incluyendo fijación, macroscópica seccionamiento, procesamiento, de parafina inclusión, inclusión de las muestras6,7.

Todos estos pasajes que implican manipulación de la muestra están sujetos a errores manuales, incluyendo la inclusión manual de las muestras y, en menor medida, microtomo manual corte y tinción. En la actualidad, todo el proceso de preparación de tejido murino para la evaluación histológica se basa en protocolos manual y protocolos que varían de laboratorio a laboratorio. El objetivo de este estudio es implementar protocolos estandarizados automatizados para reducir errores y variabilidad en la examinación histopatológica murina.

A nuestro conocimiento, Describimos aquí los primeros protocolos de tejido completamente automatizado de procesamiento y embebido para la evaluación histológica de los tejidos murinos; Estos se utilizan habitualmente en las unidades de patología para el análisis de muestras humanas. Como un ejemplo práctico de la viabilidad del método, un modelo murino de inflamación intestinal ha sido analizado, es decir,, el modelo de colitis crónica causada por la administración repetida de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en el agua potable8 ,9. Este ajuste experimental de cerca se asemeja a humano inflamatoria intestinal (EII) las enfermedades10 puesto que animales tratados con DSS exhiben signos de inflamación intestinal, por ejemplo, pérdida de peso, heces sueltas o diarrea y acortamiento del colon, así como fibrosis 8,9,11. Como observado en pacientes humanos con enfermedad inflamatoria intestinal, tratamiento de DSS genera un curso de la enfermedad compleja. En este contexto, elaboradas evaluaciones histológicas están obligadas a entender la profunda alteración de la arquitectura del tejido. Así, la aplicación de los protocolos descritos para aumentar la calidad de preparación de la muestra podría beneficiarse los investigadores basándose en la interpretación de histológicos y análisis immunohistochemical para la configuración experimental murino. Modelos experimentales murinos de enfermedades humanas que implican alteraciones de la arquitectura del tejido, la presencia de infiltrado de tejido celular o inflamación de diferentes tejidos y órganos (intestino, cerebro, hígado, piel) puede utilizar el aumento de la calidad de la preparación de muestras para examen histopatológico.

Protocol

Procedimientos animales fueron aprobados por el Ministerio de salud (auth. 127/15, 27/13) y siguieron las pautas de cuidado de los animales del Instituto Europeo de Oncología IACUC (Comité de uso y cuidado Animal institucional) 1. crónica Colitis inducción administración de DSS repetitivas Independiente edad y sexo igualada ratones en 2 grupos (DSS tratamiento vs control H2O, al menos 5 hermanos de camada de ratones por grupo experimental). Administrar 2.5% …

Representative Results

La colitis crónica experimental inducida por la administración repetida de DSS en el agua potable es un modelo murino de inflamación intestinal muy parecidas a la humana EII8,9. La figura 1 describe los efectos del tratamiento de DSS, incluyendo colon acortar (figura 1A), un parámetro utilizado para anotar la presencia de la inflamación inducida por DSS y colon expre…

Discussion

Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especíme…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Departamento de patología del IRCCS Policlinico Hospital, Milan para el soporte técnico y la facilidad de Animal de IEO para asistencia en la ganadería.

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Riferimenti

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
  7. Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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Citazione di questo articolo
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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