Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı
Summary
Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) farklı cep ve doku bölmeleri içinde doğru ve belirli algılama redoks düzenlenir sinyal biyolojik ayarlarında çalışması esastır. Elektron paramagnetic rezonans sprektroskopisidir (EPR) serbest radikallerin belirsizliğe yer bırakmadan değerlendirmek için yalnızca doğrudan yöntemidir. Onun avantajı yüksek özgüllük ile belirli türlerin fizyolojik düzeyleri algılar, ama özel teknolojisi, dikkatli numune hazırlama ve uygun denetimleri doğru verilerin yorumlanması sağlamak için gerektirir. Çevrimsel hydroxylamine spin probları seçerek süperoksit veya EPR spektroskopisi tarafından sayısal bir nitroxide sinyal oluşturmak için diğer radikalleri ile tepki. Hücre geçirgen spin probları ve spin probları hızla mitokondri içinde birikir için tasarlanmış farklı hücresel kompartmanlarda süperoksit konsantrasyon belirlenmesi için izin verir.
Kültürlü hücreleri, hücre geçirgen 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) ile birlikte ve hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz (SOD) Önarıtma olmadan kullanımı veya hücre geçirgen PEG-SOD kullanımı, sağlar ekstrasellüler sitozolik süperoksit üzerinden farklılaşma. Mitokondriyal 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium ve (mito-TEMPO-H) için ölçüm sağlar Mitokondrial ROS (ağırlıklı olarak süperoksit).
Spin sonda ve EPR spektroskopisi vivo içinde modelleri için de uygulayabilirsiniz. Süperoksit ekstraselüler sıvı kan ve alveoler sıvı gibi yanı sıra doku akciğer dokusu gibi algılanabilir. Birkaç yöntem işlemek ve doku EPR ölçümler için depolamak ve intravenöz 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonda içinde vivoteslim için sunulmaktadır. Ölçümler-ebilmek var olmak kılınmak oda sıcaklığında iken, vitro ve in vivo modellerden alınan örnekleri de-80 ° C’de saklanabilir ve 77 K. EPR tarafından analiz Örnekleri özel boru istikrarlı-80 ° C’de depolanan ve bir pratik, verimli, etkinleştirmek için 77 K ve depolama ve aktarma örnekleri kolaylaştırır tekrarlanabilir yöntemini çalıştırın.
Introduction
Oksidatif stres ve reaktif oksijen türlerine tüm organ sistemleri arasında çeşitli hastalıkları çalışma için önemli olmakla birlikte, reaktif oksijen türleri (ROS) tespiti kısa yarılanma ömrü ve yüksek reaktivite nedeniyle zordur. Serbest radikallerin algılamak için en belirgin yöntemi bir elektron paramagnetic rezonans (EPR) tekniğidir. Spin probları daha yaygın olarak kullanılan floresan problar üstünlükleri vardır. Floresan problar nispeten ucuz ve kullanımı kolay ve hızlı, hassas ROS tespiti sağlamak olsa da, onlar manipülasyonun sinyalleri, ROS konsantrasyonları ve özgüllük1 Genel eksikliği hesaplamak için bir yetersizlik nedeniyle ciddi sınırlamalar var mı .
Biyolojik araştırmalar EPR kullanımını kolaylaştırmak için çeşitli biyolojik ilgili serbest radikal türlerin yanı sıra pO2, pH ve redoks ölçebilirsiniz probları sentezlenmiş spin çeşitli devletler2,3, 4,5,6,7. Spin tuzakları da kısa ömürlü radikaller yakalamak için geliştirilmiştir ve form uzun yaşam adducts, hangi EPR8tarafından algılama kolaylaştırır. Her iki sınıfları (spin probları ve spin tuzakları) avantajları ve sınırlamalar vardır. Bir sık kullanılan spin probları sınıfıdır EPR-sessiz ve kararlı bir nitroxide oluşturmak için kısa ömürlü radikaller ile tepki çevrimsel hydroxylamines. Çevrimsel hydroxylamines süperoksit ile 100 kez spin tuzakları, olanaklı kılmak onları hücresel antioksidanlar ile rekabet edebilmek daha hızlı tepki ancak özgüllüğü eksikliği ve uygun denetimleri ve radikal türler veya kaynak tanımlamak için inhibitörleri kullanılmasını sağlayın nitroxide sinyal için sorumludur. Spin sergi özgüllük yakalar süre ile farklı spektral süperoksit bindirme spin için radikal biyolojik yatkındır için desen kapana kısılmış türler üzerinde bağlı olarak, onlar yavaş kinetik var ve adducts. Uygulamalar için spin bindirme Biyomedikal araştırma9,10,11,12,13‘ te iyi belgelenmiş oldu.
Bu projenin amacı ve deneyler tasarlamaya yönelik pratik EPR yöntemleri göstermektedir için spin kullanarak süperoksit algılamak için örnek hazırlanması farklı hücresel kompartmanlarda içinde vitro ve farklı doku bölmeleri içinde vivoprobları. Birkaç el yazmaları protokolleri analiz fare modelleri için hedef farklı hücresel kompartmanlarda vitro ve işlem doku hücre geçirgen, hücre geçirimsiz ve mitokondrial hedeflenen spin probları kullanarak bu gol ile ilgili yayınlanan 14 , 15. biz kurmak bu beden edebiyat doğru emin olmak için farklı hücresel kompartmanlarda vitro içinde bir 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonda kullanarak süperoksit ölçmek için bir yaklaşım doğrulayarak ölçümler, sonuçları çarpık olası teknik sorunları vurgulayarak. Ayrıca kan, bronchoalveolar lavaj sıvı ve akciğer doku CMH spin sonda kullanarak EPR ölçümleri gerçekleştirmek için yöntemleri sağlar. Bu çalışmalar doku işlemek gibi başka bir spin robot, CPH, doku hasat önce fareler içine enjekte etmek için bir yöntem sunmak için farklı yöntemler karşılaştırın. Son olarak, politetrafloroetilin (PTFE) boru muhafazası ve transferi önce 77 K. ölçülerde EPR örnekleri için izin vermek için örnekleri depolamak için pratik bir yöntem geliştirmek
Protocol
Representative Results
Discussion
Düzenlenmiş anlayış redoks sağlık ve hastalık sinyal biyolojik ayarları üretimde serbest radikal değerlendirilmesi önemlidir ama bu tür son derece serbest radikal türlerin kısa yarılanma nedeniyle zorlu ve teknik ölçüsüdür Genel olarak kullanılan sınırlamalarla. EPR redoks biyoloji, değerli ve güçlü bir araç olduğu serbest radikallerin algılamak için sadece belirli bir yöntemdir. Bu projede, biz tasarlama deneyler ve spin kullanarak ROS probları farklı hücresel kompartmanlarda vitro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tıp Dekan’ın Stratejik Araştırma altyapı Ödülü, R01 HL086680-09 ve 1R35HL139726-01, E.N.G. ve UCD CFReT Dostluk Ödülü (o) Colorado Üniversitesi Okulu tarafından desteklenmiştir. Dr Sandra Eaton ve Dr. Gareth Eaton (Denver Üniversitesi), Dr. Gerald Rosen ve Dr. Joseph P. Kao (İstanbul Üniversitesi) ve Dr Sujatha Venkataraman (Colorado Üniversitesi, Denver) için yararlı tartışmalar ve Joanne Maltzahn, Ashley yazarlar teşekkür Trumpie ve teknik destek için Ivy McDermott (Colorado Üniversitesi, Denver).
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
Riferimenti
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochimica. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
