Este papel describe un modelo novedoso de lesión de cerebro traumática de la explosión primaria. Un tubo de descarga por aire comprimido se utiliza para exponer en vitro ratón rebanada hippocampal culturas una sola onda de choque. Este es un protocolo simple y rápido de generar una lesión de tejido de cerebro reproducible con un alto rendimiento.
Lesión cerebral traumática es una causa principal de muerte y discapacidad en poblaciones militares y civiles. Blast cerebral traumática lesión proviene de la detonación de artefactos explosivos, sin embargo, los mecanismos que subyacen a los daños cerebrales resultantes de la exposición de sobrepresión de la ráfaga no se entienden completamente y se creen que son únicas para este tipo de lesión cerebral. Modelos preclínicos son herramientas cruciales que contribuyen a entender mejor la lesión del cerebro inducida por la explosión. Se desarrolló un modelo TBI novela en vitro blast utilizando un tubo de descarga abierta para simular las olas de la vida real campo abierto explosión modeladas por la forma de onda de Friedlander. Culturas de rebanada hippocampal organotypic ratón C57BL/6N fueron expuestas a la sola ondas de choque y el desarrollo de lesiones se caracterizó hasta 72 h utilizando yoduro de propidio, un marcador fluorescente bien establecido de daño celular que solamente penetra en las células con comprometida de las membranas celulares. Fluorescencia de yoduro de propidio fue significativamente mayor en los sectores expuestos a una onda de explosión cuando se compara con rebanadas de simulacro durante toda la duración del protocolo. Lesión del tejido cerebral es muy reproducible y proporcional a la sobrepresión de pico de la onda de choque aplicada.
Lesión cerebral traumática (TBI) por explosión es un tipo complejo de la lesión cerebral que resulta de la detonación de artefactos explosivos1,2. Blast TBI ha emergido como un importante problema de salud en los últimos 15 años con los conflictos militares recientes en Irak y Afganistán2,3. En general, se estima que entre el 4.4% y 22,8% de soldados que regresan de Irak y Afganistán han sufrido TBI suave, una gran proporción de ellos está relacionado con explosión, con una mayor tasa informó de la explosión TBI en las fuerzas de Estados Unidos en comparación con las fuerzas de UK4 ,5.
El uso de dispositivos explosivos improvisados ha sido responsable de la mayoría del trauma asociado de explosión, incluyendo ráfaga TBI, soportada por el fuerzas militares6. La detonación de una carga explosiva resulta en una muy rápida, pero transitoria, aumento de presión, que ocurre en milisegundos. La onda de sobrepresión resultante de una explosión de campo libre de la vida real es modelada por la función de Friedlander, con una subida repentina a la sobrepresión máxima seguida de un decaimiento exponencial7,8. La gama de fuerzas extremas y su curso rápido tiempo de respuesta en un evento de explosión generalmente no tienen experiencia en traumas de la explosión no1,9. La sobrepresión máxima, que es la presión máxima de la onda y la duración de la onda positiva se cree que son contribuidores importantes a la lesión cerebral de la ráfaga y éstos dependen de la carga explosiva y la distancia de la detonación de10, 11.
El trauma que los resultados de un soplo explosivo está clasificado como cuatro componentes discretos, denominados primario, secundario, terciario y cuaternario de la ráfaga lesión10,12,13,14. Cada uno de estos componentes se asocia con mecanismos específicos de lesiones. Lesión por explosión primaria resulta de la acción directa de la onda de sobrepresión en órganos y tejidos2,13. Resultados de lesión explosión secundaria del impacto de fragmentos del proyectiles, causando penetrantes y no penetrantes heridas2,15. Lesión por explosión terciaria ocurre cuando el cuerpo de la víctima es desplazado contra el suelo o los objetos y se asocia con las fuerzas de aceleración/deceleración1,10,13. Lesión por explosión cuaternario describe un grupo heterogéneo de lesiones directamente relacionados con la explosión no cubierta por la primera tres lesión mecanismos descritos12,13. Incluye (pero no se limita a) lesión termal, inhalación de humo, radiación, ondas electromagnéticas y efectos psicológicos adversos13,15. Mayoría TBI asociada a explosión da directamente en los primeros tres mecanismos de lesión, mientras que el cuaternarios mecanismos de lesión de ráfaga se asocian generalmente a lesión sistémica13. Los efectos de las fuerzas de aceleración/desaceleración (p. ej., lesión por latigazo), contundente y penetrante traumatismo craneoencefálico se han estudiado ampliamente en relación con otros tipos de TBI (p. ej., accidentes de vehículo de motor, caídas, heridas balísticas). Sin embargo, la onda de sobrepresión de la explosión primaria es exclusiva de lesión por explosión y sus efectos en el tejido cerebral son mucho menos bien entendidos16. Los mecanismos de lesión explosión primaria, asociados a una onda de sobrepresión, son las primeras de las fuerzas mecánicas para interactuar con el cerebro.
Numerosos modelos preclínicos de TBI se han desarrollado en las últimas décadas que han sido invaluables para entender blast TBI mecanismos de lesión y de la patofisiología e investigar potenciales nuevos tratamientos, que de otro modo sería imposibles hacerlo exclusivamente en la clínica entorno17,18,19. Aunque ningún modelo preclínico solo puede reproducir la complejidad del trauma de cerebro de explosión clínica, típicamente diversos modelos preclínicos de TBI replican aspectos distintos de TBI humana. La acción perjudicial de las fuerzas asociadas con una explosión de la explosión puede ser estudiada de forma aislada o en combinación en modelos TBI de explosión tanto in vitro e in vivo . Modelos in vitro tienen la ventaja de permitir un control estricto del ambiente experimental (tejido condiciones fisiológica y biomecánica de la lesión), lo que reduce la variabilidad biológica y mejora la reproducibilidad, que permita el estudio de específico molecular cascadas sin los factores de confusión presentes en animales modelos20. Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de vitro para investigar los efectos de la explosión primaria en tejido cerebral. El objetivo fue desarrollar un modelo con una onda de choque supersónica con un representante de la forma de onda de Friedlander de una explosión, campo libre como la producida por un artefacto explosivo improvisado (IED).
Entre todos los mecanismos de lesión asociada con explosión de TBI (mecanismos de lesión la explosión primaria, secundaria y terciaria), principal lesión por explosión es único al trauma de la ráfaga y es el menos entendían de los mecanismos asociados de ráfaga1,2 . El nuevo protocolo descrito aquí fue desarrollado para estudiar la explosión primaria TBI utiliza un tubo de descarga abierta para exponer en vitro ratón rebanada hippocampal culturas una sola onda de choque mediante un protocolo sencillo y rápido que permite la creación de un reproducible explosión principal TBI con un alto rendimiento.
Los primeros en vitro blast primaria TBI modelos aplican ondas de la presión hidrostática a células26,27. Sin embargo, la salida de presión no modelo la función de Friedlander, la duración de un pulso de presión hidrostática fue mucho más larga que la de ondas de sobrepresión blast aéreo13. La característica función de Friedlander se puede modelar fácilmente en el laboratorio utilizando un tubo de descarga1,8. El tubo de descarga puede producir ondas de choque que simulan explosiones de campo abierto de la vida real en un entorno de laboratorio convencional, permitiendo un control preciso de los parámetros de la onda, como la sobrepresión máxima, duración de la onda positiva y el impulso, variando la material del diafragma y grueso y el conductor volumen8,28,29.
Simple en vitro modelos como cultivos celulares suelen carecen de la heterogeneidad de tipos de la célula y de la conectividad sináptica30. Recientemente, el efecto de la explosión en vitro de la célula de cerebro ‘esferoides’ incorporando diferentes tipos de células ha sido investigado31. Se merecía una investigación adicional de estas preparaciones interesantes; sin embargo, no está claro cómo su organización celular y conectividad refleja el cerebro intacto. OHSC son un bien establecido en vitro modelo experimental23,32, son fáciles de la cultura y su Citoarquitectura del tejido tridimensional, diferenciación celular y conectividad sináptica están bien conservados y muy similar a ese en vivo33,34,35,36. OHSCs representan un nivel intermedio de complejidad entre la cultura de célula y un en vivo modelo23,32. OHSCs se han demostrado para reproducir in vitro patológicos neurodegenerativos cascadas en modelos en vivo y han sido muy útiles en la investigación de fármacos neuroprotectores potenciales y en la comprensión de sus mecanismos de acción17,21,22,37,38. Finalmente, el área anatómica estudiada, el hipocampo, es altamente relevante en los estudios TBI traslacionales, ya que esta región se daña con frecuencia en pacientes TBI39,40,41. OHSC han utilizado a la explosión del modelo TBI28,42,43,44, sin embargo, nuestro modelo es relativamente simple y puede ser adaptado a los tubos de descarga existentes ya sea horizontal o vertical configuraciones sin adaptaciones complejas.
OHSC puede conservarse en la cultura para muchos días, que facilita la investigación de los procesos biológicos sobre tiempo34. En este modelo, la lesión tisular resultante de la exposición de ondas de choque se midió diariamente durante tres días, después de la exposición de la ráfaga con yoduro de propidio, un marcador bien establecido del daño celular. Yoduro de propidio es un tinte no tóxico altamente polar que penetra en las células con las membranas celulares comprometidas, donde se une a los ácidos nucleicos y exhibe una característica fluorescencia roja brillante24,25,45. La fluorescencia medida con yoduro de propidio ha demostrado tener una buena correlación con el recuento de célula lesionada con46,47de tinción de Nissl.
Dado que la lesión producida en este modelo se difusa (figura 2), la fluorescencia de la rodaja entera se midió al realizar el análisis, similar a trabajos previamente publicados en otro cerebro lesiones paradigmas21,22 , en lugar de utilizar regiones específicas, como se ha hecho en otros en vitro blast TBI modelos28,43,44,48. El enfoque utilizado en el modelo descrito en este artículo también elimina la variabilidad potencial que se presenta cuando exponiendo regiones de interés definidas y proporciona una imagen más completa de las lesiones relacionadas con la explosión. Sobrepresiones de pico de la onda expansiva, el kPa 50 y 55 kPa, producir significativa (p < 0,05 y p < 0.0001, respectivamente) lesiones en comparación con rebanadas de sham (figura 2B). Como se anticipó, la onda de choque con la más alta sobrepresión máxima, kPa 55, producido más daños que la onda de 50 kPa. En un modelo en vitro con cerebro aislado el tejido directamente expuestos a una onda de choque, cómo escalar con precisión a todo el organismo o un ser humano no es sencillo. Sin embargo, las ondas de choque que están dentro de la gama de la sobrepresión máxima observados en el campo, normalmente 50 – 1.000 kPa8,49.
Con el fin de mantener la OHSC expuesto a la temperatura fisiológica y niveles de oxígeno y dióxido de carbono, asegurando que estaban libres de contaminación a través del Protocolo de exposición de ondas de choque, los insertos de cultivo de tejidos fueron sellados en estéril bolsas de polietileno, siguiendo una técnica aséptica, sumergida en medio experimental calentado a 37 ° C y recién burbujas con 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono, igual que trabajo anteriormente publicado28,43,44 ,48. Contrario a estos modelos donde los dispositivos complejos fueron utilizados para sostener las bolsas estériles durante la exposición de ondas de choque, en el presente Protocolo, un método simple y rápido se utilizó para suspender los insertos de cultivo de tejidos OHSC delante de la salida del tubo de descarga (figura 1A, C ). El modelo descrito en este documento permite el procesamiento rápido y alto rendimiento, minimizando el riesgo de hipotermia. Estos aspectos son especialmente relevantes para los estudios de neuroprotección dado que algunas intervenciones terapéuticas pueden tener una ventana de tiempo muy limitado de aplicación potencial después de TBI. Este protocolo de exposición de la novela de la onda expansiva permite 6 a 9 cultivo de tejidos inserta (generalmente de 36 a 54 hippocampal organotypic rebanadas de tejido) para ser expuesto a una onda de choque en un intervalo corto de tiempo (aproximadamente 1 hora).
Los OHSCs requieren buena técnica aséptica en todo. Es importante utilizar una campana de flujo laminar aséptica durante todo el cultivo y cuando se transfiere a las bolsas estériles para la explosión. Para llevar a cabo la proyección de imagen de segmento bajo condiciones asépticas con las tapas de las placas de 6 pozos en el lugar, usamos anillos metálicos a la medida para elevar los insertos de cultura de célula para el plano focal del microscopio. Una parte importante de nuestro protocolo es que incluyamos lonchas sham ileso en todos los experimentos. Rebanadas de farsa tratan idénticamente a rebanadas de explosión con la excepción de que no se enciende el tubo de descarga; otro paso importante es que todos los sectores son imagen 1 h antes de la lesión o el tratamiento simulado, para garantizar que la salud de la población de sectores utilizados son idénticos (figura 2B).
Además de cuantificar la lesión de la célula en las rebanadas con el tiempo, el tejido puede ser fijo al final del experimento para inmunohistoquímica convencionales50. Desarrollamos y evaluamos el método utilizando rebanadas de hipocampo de ratón. Sin embargo, nuestra técnica podría ser fácilmente adaptado a utilizar otros tejidos que pueden cultivarse en la cultura, como la médula espinal, retina, pulmón o tejido epitelial. En este trabajo y nuestro trabajo anterior con el modelo, hemos investigado sólo el efecto de la exposición de una sola explosión. Sin embargo, el modelo sería idóneo para investigar los efectos de repetidas explosiones de bajo nivel en el cerebro u otro tejido. OHSCs se pueden mantener en cultivo durante muchas semanas o incluso meses, permitiendo efectos crónicos a investigarse.
Los modelos in vitro , siendo más simples que los modelos en vivo , tienen un rendimiento más alto, son menos costoso y experimentos pueden completarse generalmente en un corto tiempo escala17. Sin embargo, los resultados obtenidos en vitro modelos deben ser validadas en modelos animales como en vitro cultivados los tejidos se mantienen en un ambiente artificial y pueden responder a lesiones diferentemente de lo que lo harían en vivo17. No obstante, en vitro modelos han sido extremadamente valiosos para aumentar nuestra comprensión del cerebro lesiones cascadas y en investigación de drogas neuroprotective antes del uso de la más compleja en vivo modelos17,22 , 51 , 52. a pesar de las numerosas ventajas ofrecieron por este modelo, es importante tener en cuenta que en vitro modelos carecen de la clave características de TBI presentan en animales y en modelos en vivo , como los efectos sobre el sistema vascular, aumento intracraneal presión, respuesta inmune sistémica y deterioro funcional de la conducta, que pone de relieve la necesidad de validar los resultados encontrados en modelos en vitro en el animal entero. Sin embargo, en vitro modelos como el modelo descrito en este artículo son muy útiles herramientas científicas forma relevantes.
En conclusión, este trabajo describe un método novedoso y sencillo donde exponen tejido hippocampal organotypic de las culturas de ratón a firmemente controladas y reproducibles reales correspondientes ondas de choque mediante un tubo de descarga de laboratorio. La lesión global resultante, que se cuantificó utilizando yoduro de propidio, un marcador bien establecido del daño celular, es muy reproducible y es proporcional a la sobrepresión máxima de las ondas de choque aplicadas.
The authors have nothing to disclose.
Apoyado por: centro real de medicina de la defensa, Birmingham, Reino Unido, centro Legión británica real explosión lesiones estudios, Imperial College de Londres, Reino Unido. Consejo de investigación médica, Londres, Reino Unido (MC_PC_13064; MR/N027736/1). La seguridad de Gas Trust, Londres, Reino Unido. Rita Campos-Pires recibió un premio de formación doctoral de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Lisboa, Portugal. Katie Harris recibió una beca de doctorado de la Westminster Medical School Research Trust, Londres, Reino Unido.
Este modelo fue desarrollado con el apoyo de la Legión británica real para estudios de lesión Blast (RBLCBIS) en el Imperial College. Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Legión británica real. Los investigadores interesados en colaboraciones o detalle adicional pueden comunicarse con los autores o RBLCBIS.
Agradecemos Dr. Amarjit Samra, Director de investigación, centro de la real defensa medicina, Birmingham, Reino Unido, para apoyar este trabajo, Scott Armstrong, Departamento de cirugía y cáncer, Imperial College de Londres, para obtener ayuda con experimentos preliminares , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora y Luz Ngoc Nguyen, Departamento de Bioingeniería Imperial College de Londres y William Proud, Departamento de física de Imperial College de Londres, para asesoramiento sobre el tubo de descarga, Raquel Yustos, técnico, Departamento de investigación de Ciencias de la vida, Imperial College London, para encargado de taller de apoyo técnico, Paul Brown MBE y Steve Nelson, técnico del taller, Departamento de física del Imperial College de Londres, para hacer el metal anillos, Neal Powell del Departamento de física, Imperial College London, para obra de arte.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |