Этот документ описывает модель Роман первичного взрыва черепно-мозговой травмы. Пневматический привод шок трубка используется для предоставления в vitro мыши гиппокампа ломтик культур к одной ударной волны. Это простой и быстрый протокол генерации воспроизводимый мозговая травма ткани с высокой пропускной способностью.
Черепно-мозговая травма является ведущей причиной смерти и инвалидности в военных и гражданского населения. Доменная черепно-мозговой травмы результаты от подрыва взрывных устройств, однако, механизмы, которые лежат в основе мозга, ущерб от воздействия избыточного давления взрыва полностью не поняты и считается являются уникальными для этого типа черепно-мозговой травмы. Доклинические модели являются ключевыми инструментами, которые способствуют лучше понять взрыв индуцированной черепно-мозговой травмы. Была разработана модель Роман в vitro взрыва TBI, с использованием открытого шок трубки для имитации реальной жизни открытое поле взрыва волны моделируется Фридлендер сигнала. C57Bl/6Н мыши organotypic гиппокампа ломтик культур были подвержены одной ударной волны и развитие травмы характеризовалась до 72 ч с помощью пропидий йодидом, устоявшихся флуоресцентные маркер повреждения клеток, что только проникает клетки с под угрозой клеточных мембран. Пропидий йодидом флуоресценции был значительно выше в ломтики воздействию ударной волны, когда по сравнению с кусочками Шам протяжении протокола. Повреждения тканей мозга, воспроизводимость и пропорциональна пик избыточного давления ударной волны применяется.
Доменная черепно-мозговой травмы (ЧМТ) представляет сложный тип, черепно-мозговой травмы в результате взрыва взрывного устройства1,2. Доменная TBI стала основной проблемой здравоохранения за последние 15 лет с недавних военных конфликтов в Ираке и Афганистане2,3. В целом предполагается, что между 4,4% и 22,8% солдат, возвращающихся из Ирака и Афганистана страдают мягкой TBI, большая часть которых, связанные с взрыва, с более высокой ставкой сообщил взрыва TBI в силах США, по сравнению с силами Великобритании4 ,5.
Использование самодельных взрывных устройств был ответственны за большую часть взрыва связанные травмы, включая взрыв TBI, переживаемые военнослужащими6. Детонация взрывного заряда приводит к очень быстрому — но переходных — увеличение давления, происходящих в миллисекундах. Результате избыточного давления волны от реальной жизни свободного поля взрыва моделируется функцией Фридлендер, с подъем на пик избыточное следуют экспоненциального распада7,8. Спектр экстремальных сил и их быстрое время курс, видели в случае взрыва обычно не испытывали в не Доменная травм1,9. Избыточное давление пик, который является максимальное давление волны и продолжительность положительная волна считаются важными факторами, способствующими взрыв мозга травмы и они зависят от взрывной заряд и расстояние от детонации10, 11.
Травма, что результаты от энергетический взрыв классифицируется как четыре дискретных компонентов, отнесенных к первичной, вторичной, третичной и четвертичной взрыва травмы10,12,,1314. Каждый из этих компонентов связан с конкретными механизмами получения травмы. Первичного взрыва ущерб является результатом прямого действия волны избыточного давления на органы и ткани2,13. Результаты вторичного взрыва травмы от воздействия снаряда фрагментов, вызывая проникновения и непроникающего раны2,15. Третичный взрыва травмы возникает, когда тело жертвы смещается от земли или окружающих предметов и связан с ускорение/замедление силы1,10,13. Четвертичные взрыва травмы описывает группу гетерогенных травм, непосредственно связанных с взрыва, не охватываемых первых трех травмы механизмы описанных12,13. Это включает в себя (но не ограничивается) термической травмы, вдыхания дыма, радиации, электромагнитных волн и негативные психологические последствия13,15. Большинство TBI взрыв связанные результаты непосредственно из первых трех механизмов травмы, в то время как четвертичные механизмы взрыва травмы обычно связаны с системными травмы13. Эффекты ускорения/замедления сил (например, шейного отдела позвоночника), тупые и проникающего черепно-мозговой травмы широко изучены связи с другими видами TBI (например, дорожно-транспортных происшествий, водопад, Баллистический травмы). Однако основной ударной волны избыточного давления является уникальным для взрыва травмы, и его влияние на ткани головного мозга являются гораздо менее хорошо понимали16. Первичного взрыва травмы механизмы, связанные с избыточным давлением волны, являются первыми механических сил взаимодействовать с мозгом.
Многочисленных доклинических TBI модели были разработаны в течение последних десятилетий, которые неоценимое значение для понимания механизмов TBI взрыва травмы и патофизиологии и исследовать потенциал новых методов лечения, которые в противном случае было бы невозможно сделать исключительно в клинической установка17,18,19. Хотя ни одна доклинических модель можно воспроизвести сложности клинической взрыв мозга травмы, обычно различных доклинических моделей TBI реплицировать различные аспекты человеческого TBI. Повреждающего действия сил, связанных с взрывом взрыва могут изучаться изолированно или в сочетании в моделях TBI взрыв как in vitro и in vivo . В vitro модели имеют преимущество, позволяя жесткий контроль над экспериментальной среды (физиологические условия ткани и биомеханики травмы), который уменьшает биологической вариативности и улучшает воспроизводимости, позволяя изучение конкретные молекулярные каскады без усложняющих в животных моделей20. Нашей целью было разработать модель в пробирке , чтобы исследовать эффекты первичного взрыва на ткани головного мозга. Мы стремились разработать модель с сверхзвуковой ударной волны с представителем Фридлендер сигнала взрыва свободном поле, например, производимый самодельного взрывного устройства (СВУ).
Среди всех механизмов травмы, связанные с Доменная TBI (первичной, вторичной и третичной взрыва травмы механизмы), первичного взрыва травмы является уникальным для взрыва травмы и это наименее понимаемых взрыв связанные механизмы1,2 . Роман протокол, описанные здесь был разработан для изучения первичного взрыва TBI, с использованием открытого шок трубки подвергать гиппокампа срез в vitro мыши культур к одной ударной волны, с помощью простой и быстрый протокол, который позволяет создание воспроизводимых первичный взрыв ЧМТ с высокой пропускной способностью.
Первые в vitro первичного взрыва TBI модели применяется гидростатического давления волны до клеток26,27. Однако выходного давления не модель функцию Фридлендер, как продолжительность импульса гидростатического давления было гораздо больше, чем бортовых взрыва избыточное давление волны13. Характеристика Фридлендер функции можно легко смоделировать в лаборатории с помощью трубки шок1,8. Трубка шок может производить ударных волн, которые имитируют реальные открытое поле взрывы в обычных лабораторной среде, позволяя точный контроль параметров волн, как пик избыточного давления, положительная волна продолжительность и импульса, варьируя Материал мембраны и толщины и водитель объем8,28,29.
Простой в vitro модели таких культур клеток обычно не хватает неоднородность типов клеток и синаптической связи30. Недавно эффект взрыва на в пробирке клеток головного мозга «сфероидов» включения различных типов клеток была исследованы31. Заслуживают дальнейшего расследования этих интересных препаратов; Однако не ясно, как их клеточной организации и подключения зеркала нетронутыми мозга. Страховой, установившаяся в vitro Экспериментальная модель23,32, легко культуры и их трехмерные ткани cytoarchitecture, дифференцировки клеток и синаптической связи хорошо сохранились и очень Аналогично этому в vivo33,34,,3536. OHSCs представляют собой промежуточного уровня сложности между клеточной культуры и в естественных условиях модель23,32. OHSCs были продемонстрированы воспроизвести в пробирке патологических нейродегенеративных каскады видели в в естественных условиях модели и были очень полезны в скрининг потенциальных нейропротекторной наркотиков и в понимании их механизмов меры17,21,22,,3738. Наконец анатомической области учился, гиппокамп, является весьма актуальным в трансляционной TBI исследований, как этот регион часто повреждены в ЧМТ пациенты39,40,41. Страховой были использованы для Доменная модель TBI28,42,,4344, однако, наша модель является относительно простым и может быть адаптированы к существующим шок трубы в любой горизонтальной или вертикальной конфигурации без комплекса адаптация.
Страховой может храниться в течение многих дней, культуре, которая облегчает исследование биологических процессов над время34. В этой модели, повреждение тканей в результате воздействия ударной волны была измерена ежедневно более трех дней, после взрыва воздействия, с помощью пропидий йодидом, устоявшихся маркер повреждения клеток. Пропидий йодидом является нетоксичных весьма полярные красителем, который проникает клетки с нарушенной клеточных мембран, где он связывается с нуклеиновыми кислотами и выставок характерной ярко красной флуоресценции24,25,45. Флуоресцирование, измеренная с пропидий йодидом было показано, имеют хорошее соотношение с отсчет потерпевшего клетки с помощью Ниссль пятнать46,47.
Учитывая, что травмы, производимых в этой модели был диффузным (рис. 2 c), флуоресценции весь срез был измерен при выполнении анализа, похож на ранее опубликованные работы в других мозга травмы парадигмы21,22 , вместо использования конкретных регионов, как это было сделано в других в vitro взрыва TBI моделей28,,4344,48. Глобальный подход, используемый в модели, описанные в этой статье также устраняет потенциальные изменчивость, которая вводится при определенных областей, представляющих интерес и обеспечивает более полную картину взрыва травмы. Ударной волны пик дымозащитных и 50 кПа 55 кПа, производятся значительные (p < 0,05 и p < 0,0001, соответственно) травмы, когда по сравнению с фиктивным срезы (рис. 2B). Как и ожидалось, ударной волны с высоким пик избыточное давление, 55 кПа, производится больше вреда чем волны 50 кПа. В модели в пробирке с изолированной черепно-мозговой ткани непосредственно подвергаются воздействию shockwave, как точно масштабировать весь организм или человеческое существо не прост. Тем не менее ударной волны, которые мы использовали находятся в диапазоне пик дымозащитных наблюдается в поле, обычно 50-1000 кПа8,49.
Для того, чтобы поддерживать подвергается физиологического температуры и уровня кислорода и углекислого газа, обеспечивая, чтобы они были свободны от загрязнения на протяжении протокол воздействия ударной волны, страховой культуры ткани вставки были запечатаны в стерильных полиэтиленовые мешки после асептической техники, погруженной в экспериментальной среде прогреты до 37 ° C и свежезаваренным кипела с 95% кислорода и 5% двуокиси углерода, аналогично ранее опубликованные работы28,,4344 ,48. Нарушение этих моделей, где сложные устройства использовались для хранения стерильных сумки во время воздействия ударной волны, в этом протоколе простой и быстрый метод был использован для приостановить страховой культуры ткани вставки перед ударной трубки розетки (Рисунок 1A, C ). Модель, описанную в настоящем документе позволяет быстрой обработки и высокой пропускной способности, минимизируя риск гипотермии. Эти аспекты особенно актуальны для исследования нейропротекторного эффекта, учитывая, что некоторые терапевтические мероприятия могут иметь весьма ограниченное время окно потенциальное применение после ЧМТ. Этот роман ударной волны облучения протокол позволяет 6-9 культуры ткани вставляет (обычно от 36 до 54 гиппокампа organotypic тканей срезы) подвергаться воздействию ударной волны в короткий промежуток времени (примерно 1 час).
OHSCs требует хорошей асептической техники во всем. Важно использовать асептических Ламинарный шкаф культивирования и при передаче в стерильные пакеты для взрыва. Для того, чтобы осуществить срез изображений в асептических условиях 6-ну пластин в месте с крышками, мы используем заказные металлические кольца для повышения культуры вставки ячейки в фокальной плоскости микроскопа. Важной частью нашего протокола является, что мы включаем ранен Шам ломтики в каждом эксперименте. Шам фрагменты обрабатываются одинаково взрыва ломтики с исключением, что не срабатывает, шок Тюбе; еще одним важным шагом является, что все фрагменты отражаются 1 h до травмы или лечения Шам, для обеспечения здоровья населения ломтиков использовать идентичные (рис. 2B).
Помимо количественного клетки травмы в ломтики с течением времени, ткань может быть исправлено в конце эксперимента для обычных иммуногистохимия50. Мы разработали и оценены метод, с помощью мыши гиппокампа ломтиками. Однако наша техника может быть легко адаптирована для использования других тканей, которые можно выращивать в культуре, например спинного мозга, сетчатки, легких или эпителиальной ткани. В этом документе и нашей предыдущей работы с моделью мы исследовали только эффект воздействия одного взрыва. Однако эта модель будет хорошо подходит для изучения воздействия повторных низкоуровневых взрывов на мозга или других тканей. OHSCs может храниться в культуре многих недель или даже месяцев, позволяя хронические эффекты должны расследоваться.
В vitro модели, будучи проще, чем в естественных условиях модели, имеют более высокую пропускную способность, являются менее дорогостоящими и экспериментов могут быть завершены обычно короче время шкала17. Однако, результаты, полученные с помощью моделей в vitro нужно проверяться на животных моделях, как в vitro культивированный тканей хранятся в искусственной среде и могут реагировать травмы по-разному от того, что они будут в естественных условиях17. Тем не менее в пробирке модели были чрезвычайно ценным в углублении нашего понимания мозга травмы каскады и в скрининг нейропротекторной наркотиков до использования более сложных в естественных условиях модели17,22 , 51 , 52. Несмотря на многие преимущества этой модели, важно отметить, что в vitro модели не имеют ключ, особенности TBI присутствует в животных и в естественных условиях модели, такие как воздействие на сосудистой системы, увеличение внутричерепного давление, системный иммунный ответ и функциональной поведенческой обесценение, который подчеркивает необходимость проверить результаты, найденные в моделях в пробирке в целом животного. Тем не менее в пробирке модели, например модель, описанных в данном документе являются чрезвычайно полезным translationally соответствующие научные инструменты.
В заключение эта работа описывает метод простой и прямой роман, где мыши organotypic гиппокампа культур тканей подвергаются плотно контролируемой и воспроизводимость реальных соответствующих ударных волн с помощью трубки шок лаборатории. Результате глобальной травмы, которая была количественно с помощью пропидий йодидом, устоявшихся маркер повреждения клеток, легко воспроизводимые и пропорциональна пик избыточного давления ударной волны применяется.
The authors have nothing to disclose.
Поддерживается: Королевский центр обороны медицины, Бирмингем, Великобритания, Королевский британский легион центр исследований взрыва травмы, Имперский колледж Лондона, Соединенное Королевство. Совет медицинских исследований, Лондон, Соединенное Королевство (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Газовой безопасности доверия, Лондон, Соединенное Королевство. Рита Кампос-Пирес был удостоен докторской подготовки награду от фонда пункт Ciência e Tecnologia, Лиссабон, Португалия. Кэти Харрис был удостоен докторской студенчества от Вестминстера медицинской школе исследований траст, Лондон, Соединенное Королевство.
Эта модель была разработана при поддержке центра Королевский британский легион для взрыва травмы исследований (RBLCBIS) в Имперском колледже. Мы хотели бы отметить финансовую поддержку в Королевский британский легион. Исследователей, заинтересованных в сотрудничестве или более подробно может связаться с авторами или RBLCBIS.
Мы благодарим д-р Амарджита Самра, директор по исследованиям, Королевский центр обороны медицины, Бирмингем, Соединенное Королевство, для поддержки этой работы, Скотт Армстронг, Кафедра хирургии и рак, Имперского колледжа Лондона, для помощи с предварительные эксперименты , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Нгуен Нгок, Департамент биоинженерии Имперского колледжа Лондона, Уильям гордый, Департамент из физики Имперского колледжа Лондона, для консультации по шок трубка, Ракель Yustos, техник, Департамент исследований Наук о жизни, Имперского колледжа Лондона, для технической поддержки, Пол Браун MBE, руководитель мастерской и Стив Нельсон, мастерская техник, Кафедра физики, Имперского колледжа Лондона, для изготовления металлических кольца, Нил Пауэлл кафедрой физики, Имперский колледж Лондона, для иллюстрации.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |