Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, Forscher der Electrogenesis des zentralen Nervensystems (ZNS) in das Modell Insekt, Drosophila Melanogasterschnell messen können. Diese Methode ist zuverlässig, schnell und kosteneffizient durchzuführen physiologische und toxikologische Experimente. CNS ist wichtig für Leben und daher die physiologischen Wege kritischer für ordnungsgemäße neurale Funktion haben ausgiebig erforscht wurden, in einer Bemühung zu verstehen oder neuronale Funktion zu ändern. Charakterisierung der Signalwege innerhalb der Arthropoden CNS ermöglichte die Entdeckung von mehreren chemischen Klassen von Insektiziden, die Wirbellosen neuronale Funktion, um Sterblichkeit zu induzieren, während Ziel folgen zu begrenzen, zu stören. Somit ist die Fähigkeit, die neuronale Aktivität der Insekten zu messen von wesentlichem Interesse auf dem Gebiet der Insekten Toxikologie und Physiologie, da das Nervensystem das Zielgewebe der Mehrheit der eingesetzten Insektizide^{1 ist}. Doch weiter Wachstum von Grundlagen- und anwendungsorientierte Kenntnisse über das Insekt Nervensystem erfordert fortgeschrittene neurophysiologische Techniken, die in der Machbarkeit, begrenzt sind, da aktuelle Techniken arbeitsintensiv sind und erfordern einen hohen Aufwand, Insekt neuronale Zelllinien sind begrenzt, und/oder es gibt begrenzten Zugang zu den zentralen Synapsen der meisten Arthropoden. Charakterisierung der meisten Insekten neuronaler Proteine erfordert derzeit, das Ziel zu geklonten und heterologously ausgedrückt für nachfolgende Wirkstoffsuche und elektrophysiologische Aufnahmen, wie für Insekt nach innen Gleichrichter Kaliumkanäle^{2 beschrieben wurde} , Insekt Ryanodin-Rezeptor³, Moskito Spannung-empfindliche K⁺ Kanäle⁴und andere. Um die Anforderung für die heterologe Expression und das Potenzial für geringe funktionelle Expression zu mindern, kultiviert Bloomquist und Kollegen zielte darauf ab, einen neuronalen Phänotyp in induzieren Spodoptera Frugiperda (Sf21) Zellen als eine neuartige Methode zur Insektizid Entdeckung^5,6. Diese Methoden bieten einen gültigen Ansatz für die Entwicklung der neuen Chemie, doch sie schaffen oft einen unüberwindbaren Engpass für die Charakterisierung von pharmakologischen Wirkstoffen, Mechanismen der Insektizid Widerstand und Charakterisierung der physiologischen Grundprinzipien. Hier beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode, die es ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einer Modell-Insekt, die formbar Genetik^7,8,9 hat und bekannte Expressionsmuster von neuronalen komplexe^10,11,12 , die Charakterisierung von Resistenzmechanismen auf der Ebene der Nerven, die Wirkungsweise von neu entwickelten Medikamenten und anderen toxikologischen Studien zu ermöglichen.

Der Fruchtfliege, D. Melanogaster, ist gemeinsame Modellorganismus für die Definition von Insekten Nervensysteme oder Insektizid Wirkmechanismus und etabliert sich als Modellorganismus gut geeignet für das Studium der toxikologischen¹³, pharmakologische^{14 ,15}, neurophysiologische¹⁶und pathophysiologischen^17,18,19,20 Prozesse der Wirbeltiere. D.melanogaster ist ein holometabolous Insekt, die komplette Metamorphose, einschließlich ein Larven- und pupal Stadium vor Erreichen der reproduktiven Erwachsenstadium ausführt. Während des Entwicklungsprozesses das Nervensystem unterliegt erheblichen Umbau in verschiedenen Lebensphasen, aber die Larven CNS werden im Mittelpunkt dieser Methodik. Die voll entwickelte Larven CNS ist anatomisch einfach mit thorakalen und abdominalen Segmenten, die sind verschmolzen und bilden die ventralen Ganglion, die ein Array von wiederholten und fast identischen Neuromeric Einheiten^21,22darstellt. Absteigende motorische Nerven stammen aus dem kaudalen Ende des Subesophageal Ganglien und hinabsteigen, um die Körperwand Muskeln und viszeralen Organe der Larven innervieren. Abbildung 1 beschreibt die Anatomie der Larven Drosophila CNS.

Drosophila Blut – Hirn-Schranke (BBB) am Ende der Embryogenese entwickelt und wird durch Subperineurial Gliazellen (SPG)²¹gebildet. Die SPG-Zellen bilden zahlreiche Filopodien-ähnliche Prozesse, die ausgebreitet, um eine zusammenhängende, sehr flach, Endothelzellen wie Blatt zu etablieren, das die gesamte Drosophila CNS²³abdeckt. Die Drosophila BBB hat Ähnlichkeiten mit der vertebrate BBB, Erhaltung der Homöostase der neuronalen Mikroumgebung durch die Kontrolle des Eintrags von Nährstoffen und Xenobiotika in der CNS-²¹umfasst. Dies ist eine Voraussetzung für zuverlässige neuronale Übertragung und Funktion, noch der Schutz des ZNS durch die BBB schränkt die Permeation von synthetischen Drogen, die meisten Peptide und andere Xenobiotika^24,25, das Potenzial einführt Probleme bei der Charakterisierung von Potenzen von kleinen Molekül-Modulatoren. Die Methode verwendet eine einfache Durchtrennung stören diese Barriere und pharmakologischen Zugriff auf den zentralen Synapsen.
Die größte Stärke der beschriebenen Methode ist die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und relativ hohem Durchsatz Kapazität dieses Systems. Das Protokoll ist relativ leicht zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz und nur einen ersten finanziellen Aufwand ist notwendig, die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien reduziert wird. Darüber hinaus ist das beschriebene Verfahren völlig amendable Aufzeichnen der zentrale absteigende Nerven-Aktivität von der Stubenfliege Musca Domestica²⁶.