Summary

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Published: October 08, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per tubercolosi umana modello in un adulto zebrafish utilizzando la sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum. Estratti di DNA e RNA da organi interni di zebrafish infetto può essere utilizzato per rivelare che il totale micobatterico carichi nel pesce e le risposte immunitarie dell’ospite con qPCR.

Abstract

Tubercolosi del micobatterio è attualmente il più letale agente patogeno umano causando le infezioni 10,4 milioni e 1,7 milioni di morti ogni anno. L’esposizione a questo batterio provoca uno spettro di vasta malattia negli esseri umani che vanno da un’infezione sterilizzati ad una malattia mortale attivamente di progressione. La forma più comune è la tubercolosi latente, che è asintomatico, ma ha il potenziale per riattivare in una malattia fulminante. Zebrafish adulto e sua naturale agente patogeno Mycobacterium marinum hanno recentemente dimostrato di essere un modello applicabile per studiare lo spettro di vasta malattia di tubercolosi. Soprattutto, spontaneo latenza e riattivazione, nonché risposte immunitarie nel contesto dell’infezione micobatterica può essere studiate in questo modello. In questo articolo, descriviamo i metodi per l’infezione sperimentale di zebrafish adulto, l’insieme degli organi interni per l’estrazione degli acidi nucleici per la misurazione dei carichi micobatteriche e risposta immune dell’ospite mediante PCR quantitativa. L’in-house-sviluppato, M. marinum –qPCR specifici test è più sensibile rispetto ai metodi tradizionali di placcatura, come rileva anche il DNA da micobatteri divisione, dormienti o morti di recente. Come sia DNA che RNA sono estratti dallo stesso individuo, è possibile studiare le relazioni tra lo stato malato e l’espressione genica di ospite e patogeno. Il modello di zebrafish adulto per la tubercolosi, così si presenta come un sistema altamente applicabile, non mammiferi in vivo per studiare le interazioni ospite-patogeno.

Introduction

Zebrafish (Danio rerio) è un modello animale ampiamente usato nella ricerca biomedica ed è un modello per la biologia dei vertebrati comune accettato. Zebrafish è stato adattato a molti campi di ricerca malattie umane di modellazione e disturbi che vanno da cancro1 e malattia cardiaca2 infezione e studi immunologici di diversi batteri 3 e infezioni virali4 , 5. Inoltre, lo sviluppo di ex utero degli embrioni di zebrafish ha reso zebrafish un modello popolare in biologia dello sviluppo6 e tossicologia7,8.

In molti campi della ricerca, tra cui biologia di infezione, le larve di zebrafish otticamente trasparenti sono comunemente usate. Le prime cellule immuni vengono visualizzati all’interno di fertilizzazione di 24h post (hpf), quando i macrofagi primitivi sono rilevati9. I neutrofili sono le cellule immunitarie prossime a comparire circa 33 hpf10. Larve di zebrafish sono dunque fattibile per lo studio delle prime fasi di infezione e il ruolo dell’immunità innata in assenza di cellule del sistema immunitario adattativo11. Tuttavia, zebrafish adulto con il suo sistema immunitario adattativo completamente funzionale fornisce un ulteriore livello di complessità per gli esperimenti di infezione. Le cellule di T possono essere rilevate intorno 3 giorni dopo la fecondazione12, e le cellule B sono in grado di produrre anticorpi funzionali da 4 settimane post fertilizzazione13. Zebrafish adulto ha tutte le controparti principali del sistema immunitario innato e adattivo dei mammiferi. Le principali differenze tra la immune systems di pesce e gli esseri umani si trovano in isotipi di anticorpo pure come l’anatomia dei tessuti linfoidi. Zebrafish ha anticorpi solo tre classi14, mentre gli esseri umani hanno cinque15. In assenza di midollo osseo e nei linfonodi, organi linfoidi primari nel pesce sono il rene e il timo16 e la milza, il rene e l’intestino servono come organi linfoidi secondari17. Nonostante queste differenze, con il suo arsenale completo sistema immunitario delle cellule innate e adattive, zebrafish adulto è un modello altamente applicabile, easy-to-use, non mammiferi per studi di interazione ospite-patogeno.

Zebrafish ultimamente è stato stabilito come un possibile modello per studiare la tubercolosi18,19,20,21,22. La tubercolosi è una malattia airborne causata dalla tubercolosi del Mycobacterium. Secondo l’organizzazione mondiale della sanità, la tubercolosi ha causato1.7 milione morti nel 2016 ed è la principale causa di morte da un singolo agente patogeno in tutto il mondo23. Topi24,25, conigli26 e27 di primati non umani sono che l’animale più noto modelli nella ricerca di tubercolosi ma ogni faccia loro limitazioni. Il modello di primate non umano dell’infezione di tubercolosi del M. è simile alla malattia umana più strettamente, ma utilizzando questo modello è limitato a causa di gravi considerazioni etiche. Altri modelli animali sono ostacolati dalla specificità dell’ospite-di M. tuberculosis che colpisce la patologia di malattia. Probabilmente il problema più grande nel modellare la tubercolosi è l’ampio spettro di esiti di infezione e malattia nella malattia umana: la tubercolosi è una malattia molto eterogenea, che vanno da sterilizzare l’immunità all’infezione latente, attiva e riattivato28 , che può essere difficile da riprodurre e modello sperimentalmente.

Mycobacterium marinum è un parente stretto di M. tuberculosis con proteine orthologous ~ 3.000 con 85% dell’amminoacido identità29. M. marinum infetta naturalmente zebrafish producendo granulomi, i tratti distintivi della tubercolosi, nei suoi organi interni19,30. A differenza di altri modelli animali utilizzati nella ricerca di tubercolosi, zebrafish produce molti figli, richiede solo uno spazio limitato e d’importanza, neurophysiologically è il modello di tubercolosi vertebrati meno sviluppato disponibile. Inoltre, l’infezione di M. marinum provoca infezione latente, malattia attiva o anche sterilizzazione dell’infezione micobatterica in zebrafish adulto che imita molto attentamente lo spettro di risultati di malattia di tubercolosi umana19, 31 , 32. qui, descriviamo i metodi per il modello sperimentale tubercolosi di zebrafish adulto iniettando M. marinum nella cavità addominale e utilizzando la PCR quantitativa per misurare i carichi micobatteriche e risposte immunitarie dallo zebrafish campioni di tessuto.

Protocol

Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dal comitato di esperimento animale in Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metodi vengono eseguite secondo la legge (497/2013) e il decreto del governo (564/2013) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici o educativi in Finlandia. 1. coltura di Mycobacterium marinum Nota: Poiché il marinum del micobatterio è un agente patogeno in grado di causare infezioni superficiali in esseri um…

Representative Results

L’agente patogeno di pesce naturale Mycobacterium marinum infetta gli organi interni di zebrafish e produce un’infezione sistematica con i granulomi istologicamente visibile19. Zebrafish adulto sono infettati con M. marinum tramite un’iniezione intraperitoneale. Il DNA e RNA sono estratte e micobatterica è misurato da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il DNA come il modello. La struttura del metodo è illustrata n…

Discussion

Qui descriviamo un’applicazione basata su qPCR per misurare micobatteriche carichi da DNA Estratto da tessuti infettati sperimentalmente zebrafish adulto. Questa applicazione è basata su primer disegnati intorno ai 16S-23S rRNA distanziatore interno trascritto sequenza40. Il carico totale micobatterico in un campione di pesce è stimato utilizzando una curva standard preparata dal DNA Estratto da un numero noto di micobatteri coltivati e supponendo che un batterio ha una copia del suo genoma in u…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal finlandese Cultural Foundation (H.L.), Tampere tubercolosi Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fondazione dell’associazione anti-tubercolosi finlandese (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane e Aatos Erkko Foundation (M.P.) e Accademia di Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki sono riconosciuti per la loro assistenza tecnica. Gli autori riconoscono il laboratorio di Zebrafish Tampere per il loro servizio.

Materials

Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 ml syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 ml homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

Riferimenti

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  24. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  25. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  26. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  27. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  28. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  29. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  30. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  31. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  32. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  33. Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  34. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
  35. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  36. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  37. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  38. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  39. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  40. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  41. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  42. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  43. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  44. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  45. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

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Citazione di questo articolo
Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

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