Summary

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Published: September 20, 2018
doi:

Summary

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Abstract

Gut homing van immune cellen is belangrijk voor de pathogenese van inflammatoire darmziekten (IBD). Integrine-afhankelijke cel adhesie te addressins is een cruciale stap in dit proces en therapeutische strategieën die interfereren met de hechting met succes zijn vastgesteld. Het anti-α4β7 integrine antilichaam, vedolizumab, wordt gebruikt voor de klinische behandeling van ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) en verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen.

De bijzonderheden omtrent de hechting en de mechanismen van de actie van de anti-integrine antilichamen zijn nog steeds onduidelijk is in vele opzichten als gevolg van de beperkte beschikbare technieken voor het functioneel onderzoek op dit gebied.

Hier presenteren we een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay voor de functionele analyse van menselijke cel adhesie onder stromingscondities en het effect van anti-integrine therapieën in het kader van IBD. Het is gebaseerd op de perfusie van primaire menselijke cellen tot en met addressin beklede ultradunne glas haarvaten met real-time microscopische analyse. De bepaling biedt een scala aan mogelijkheden voor verbeteringen en wijzigingen en potentieel voor mechanistische ontdekkingen en translationeel toepassingen houdt.

Introduction

Cel beweging is een stevig gereglementeerde proces onmisbaar voor de ontwikkeling en de functie van multi-cellulaire organismen, maar is ook betrokken bij de pathogenese van een veelheid aan ziekten1. Onlangs, heeft het homing proces van immuuncellen van de bloedstroom naar de perifere weefsels opgedaan steeds meer aandacht, omdat het bijdraagt tot aanvulling en uitbreiding van pathogene cellen in ontstoken weefsels in via het immuunsysteem veroorzaakte ziekten2 ,3. In het bijzonder is homing aangetoond dat translationeel relevantie in inflammatoire darmziekten (IBD). Het therapeutische anti-α4β7 integrine antilichaam vedolizumab bemoeien met gut homing werkzaamheid is gebleken in grote klinische proeven4,5 en is met succes gebruikt in de klinische praktijk levensechte6,7 , 8. verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen9,10. Het therapeutische anti-α4 integrine antilichaam, natalizumab, wordt ook gebruikt voor de behandeling van multiple sclerose (MS)11.

Onze functionele begrip van het homing proces in het algemeen en het werkingsmechanisme van dergelijke therapeutische antistoffen is in het bijzonder echter nog beperkt. Het is reeds lang gevestigd dat homing bestaat uit verschillende stappen waaronder cel binden en rollend met latere cel adhesie leidt tot stevige arrestatie gevolgd door trans endothelial migratie12,13. De bovengenoemde antistoffen neutraliseren verschijnsel op het celoppervlak voorkomen van interactie met addressins op het endotheel van de vaatwand. Dit wordt beschouwd als het belemmeren van de vaste cel adhesie14,15. Nog, we zijn pas net begonnen te begrijpen van de differentiële relevantie van specifieke verschijnsel voor cel homing van afzonderlijke cel deelverzamelingen. Bovendien, de effecten van anti-integrine antilichamen op verschillende cel subsets en dosis-respons-verenigingen zijn grotendeels onbekend leidt tot veel open vragen op het gebied van darm homing en Anti-adhesie therapieën in IBD.

Handige hulpmiddelen moeten dergelijke kwesties worden aangepakt zijn daarom hard nodig. Het effect van anti-integrine antilichamen op integrine-addressin interactie is tot nu toe voornamelijk beoordeeld door beoordeling van bindende werkzaamheid/bindende remming met stroom cytometry of via statische hechting assays16,17 ,18,19,20, dus met een schijnbare vereenvoudiging en afwijking van de fysiologische situatie. We onlangs een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay om te bestuderen van integrine-afhankelijke hechting van menselijke cellen om te addressins en de effecten van anti-integrine antilichamen onder schuifspanning2gevestigd. Het beginsel van de techniek is eerder aangetoond met de muis cellen21,22. Hier, het werd aangepast en ontwikkeld om de hierboven genoemde translationeel kwesties worden aangepakt, openen nieuwe mogelijkheden beter begrijpen van de mechanismen van therapie met anti-integrine antilichamen in vivo.

Protocol

De studies die zijn beschreven in de volgende secties zijn uitgevoerd volgens de goedkeuring van de ethische commissie van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Nuremberg. 1. bereiding van haarvaten Rechthoekige haarvaten verbinden met de rubber slang door het uitrekken van de buis aan de ene kant met kleine schaar en zorgvuldig het invoegen van het capillair (ongeveer 0.5 cm) in de buis. Verbinding tussen capillair en buis met kunststof paraffine film afdichten. Jas…

Representative Results

De methode voorgesteld in dit manuscript doelstellingen proces te simuleren de in vivo menselijke cel adhesie aan de endothelial muur zo dicht mogelijk bij functioneel beoordelen cel adhesie en de rol van storende antilichamen. Daarom zijn uiterst dunne haarvaten bedekt met addressins en geperfundeerd met fluorescently geëtiketteerde menselijke cellen van belang met behulp van een pomp perfusie. Met behulp van levende cellen imaging de hechting van menselijke cellen om de addres…

Discussion

Het bovenstaande protocol beschrijft een nuttige techniek om te bestuderen van de dynamische wrijvingscoëfficiënt van menselijke immune cellen aan endothelial liganden. Door de variatie van de gecoate liganden, geperfundeerd celtypes of deelverzamelingen, incubatie met aanvullende stimuli of verschillende neutraliserende antilichamen, heeft het bijna onbeperkte toepassingsmogelijkheden. Deze dynamische wrijvingscoëfficiënt gehaltebepalingen kunnen dus nuttig zijn om te antwoorden op beide fundamentele vragen van fund…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoek van CN, IA, MFN- en SZ werd gesteund door het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek (IZKF) en het ELAN-programma van de Universiteit Erlangen-Nuremberg, de anders Kröner-Fresenius-Stiftung, de Fritz-Bender-Stiftung, de Duitse Crohn en Colitis Foundation (DCCV), de klinische onderzoek groep CEDER van het Duits onderzoek Raad (DFG), het programma onderwerp DFG Microbiota, de opkomende Field Initiative en de DFG Collaborative Research centra 643, 796 en 1181.

Materials

48-Well plate Sarstedt 833,923
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Bovine Serum albumin (BSA) Applichem A1391,0100
CaCl2 Merck 2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length CM Scientific 3520-050
CCL-2, human Immunotools 11343384
CD4-Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFischer Scientific C34554
Centrifuge (Rotixa 50 RS) Hettrich
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
Confocal Microscope (TCS SP8) Leica
CXCL-10, human Immunotools 11343884
Dextran 500 Roth 9219.3
EDTA KE/9 ml Monovette Sarstedt
Falcons (50 mL) Sarstedt 62,547,004
Fc chimera isotype control R&D Systems 110-HG
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES VWR J848-100ML
Human IgG Isotype Control ThermoFischer Scientific 31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera R&D Systems 720-IC-050
LS-Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MgCl2 Roth
MnCl2 Roth
mouse IgG isotype control Miltenyi Biotec 130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera R&D Systems 6056-MC
NaCl Roth 3957.3
Natalizumab Biogen
Neubauer Counting chamber Roth T729.1
Pancoll, human PAN Biotech P04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Biochrom L 182-10 w/o Mg and Ca
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) VWR 52858-000
purified anti-human CD18 Biolegend 302102
RPMI Medium 1640 Gibco Life Technologies 61870-010
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length Ismatec SC0059
Serological Pipetts Sarstedt 861,254,025
Trypan blue Roth CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend 553706
Vedolizumab (Entyvio) Takeda

Riferimenti

  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  3. Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
  4. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
  5. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
  6. Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
  7. Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
  8. Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
  9. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  10. Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
  11. Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  13. Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
  14. Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
  15. Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  16. Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
  17. Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
  18. Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
  19. Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
  20. Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
  21. Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
  22. Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
  23. Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
  24. Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
  25. House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
  26. Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
  27. Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  28. Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  29. Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Becker, E., Schramm, S., Binder, M., Allner, C., Wiendl, M., Neufert, C., Atreya, I., Neurath, M., Zundler, S. Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease. J. Vis. Exp. (139), e58210, doi:10.3791/58210 (2018).

View Video