Summary

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

Published: September 20, 2018
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Summary

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

Abstract

면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.

접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.

여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.

Introduction

셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병1의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. , 8. 추가 화합물9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, natalizumab, 다 발성 경화 증 (MS)11의 치료를 위해 사용 됩니다.

그러나, 우리의 기능 유도 과정의 일반적 이해와 같은 치료 항 체의 행동의 메커니즘에 특히 아직도 제한 된다. 잘 설립 추적 셀 밧줄 등 압 트랜스 내 피 마이그레이션12,13다음 회사 마비로 이어지는 후속 세포 접착와 여러 단계의 구성 됩니다. 위에서 언급 한 항 체에 혈관 벽의 endothelium에 addressins와의 상호 작용을 방지 하는 세포 표면 integrins 무력화. 이 회사 세포 접착14,15방해 하 생각 된다. 그러나, 우리는 고유 셀 하위 집합의 셀 추적에 대 한 특정 integrins의 차동 관련성 이해만 시작 합니다. 또한, 다른에 안티 integrin 항 체의 효과 셀 하위 집합 그리고 복용량 응답 협회는 크게 알려진 많은 IBD에 직감 추적 및 방지 접착 치료의 분야에서 관련 질문을 선도.

따라서, 이러한 질문을 해결 하기 위해 편리한 도구 필사적으로 필요 합니다. Integrin addressin 상호 작용에 안티 integrin 항 체의 효과 주로 바인딩 효능/바인딩 금지 cytometry 또는 정적 접착 분석 실험16,17 를 평가 하 여 평가 18,,1920, 명백한 단순화와 생리 적 상황에서 편차에 따라서. 우리는 최근에 integrin 종속 접착 addressins 인간 세포의 전단 응력2안티 integrin 항 체의 효과 공부 하 고 동적 접착 분석 결과 설립. 기술의 원리 이전 마우스 셀21,22로 입증 되었습니다. 여기, 그것은 적응 되 고 위에서 언급 한 변환 질문을 해결 하기 위해 개발 되었다, 오프닝 소설 길 더 나은 치료와 안티 integrin 항 체에서 생체 내에서의 메커니즘을 이해.

Protocol

다음 섹션에서 설명 하는 연구 윤리 위원회 프리드리히 알렉산더 대학교 에를랑겐 뉘른베르크의의 승인에 따라 수행 되었습니다. 1입니다. 모세 혈관의 준비 작은 위 한쪽에 튜브를 스트레칭 하 고 신중 하 게 (약 0.5 c m) 모 세관 튜브에 삽입 하 여 사각형 모세 혈관 고무 튜브를 연결 합니다. 모 세관 튜브 플라스틱 파라핀 영화 사이 연결을 봉인. Addressin (재조합…

Representative Results

제시 하는 방법이이 원고에 최대한을 기능적으로 내 피 벽에 인간의 세포 접착의 과정 vivo에서 시뮬레이션 하는 것을 목표로 평가 세포 접착 및 간섭 항 체의 역할. 따라서, ultrathin 모 세관 addressins 코팅 되며 관심 관류 펌프를 사용 하 여 붙일 레이블된 인간의 세포와 끼얹는다. 라이브 셀 이미징는 addressins에 인간 세포의 접착을 사용 하 여 실시간으로 (<strong class="xf…

Discussion

위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CN, 아이오와, MFN, SZ의 연구 지원 협 센터 임상 연구 (IZKF)와 대학 에를랑겐 뉘른베르크, 독일 크 론 다른 Kröner-Fresenius-재단, 프리츠-벤더-재단의 앨런 프로그램 및 Colitis 재단 (DCCV), 임상 연구 그룹 CEDER의 독일 연구 위원회 (DFG), Microbiota, 신흥 분야 이니셔티브는 DFG 공동 연구 센터 643, 796와 1181에 DFG 주제 프로그램.

Materials

48-Well plate Sarstedt 833,923
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Bovine Serum albumin (BSA) Applichem A1391,0100
CaCl2 Merck 2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length CM Scientific 3520-050
CCL-2, human Immunotools 11343384
CD4-Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFischer Scientific C34554
Centrifuge (Rotixa 50 RS) Hettrich
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
Confocal Microscope (TCS SP8) Leica
CXCL-10, human Immunotools 11343884
Dextran 500 Roth 9219.3
EDTA KE/9 ml Monovette Sarstedt
Falcons (50 mL) Sarstedt 62,547,004
Fc chimera isotype control R&D Systems 110-HG
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES VWR J848-100ML
Human IgG Isotype Control ThermoFischer Scientific 31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera R&D Systems 720-IC-050
LS-Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MgCl2 Roth
MnCl2 Roth
mouse IgG isotype control Miltenyi Biotec 130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera R&D Systems 6056-MC
NaCl Roth 3957.3
Natalizumab Biogen
Neubauer Counting chamber Roth T729.1
Pancoll, human PAN Biotech P04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Biochrom L 182-10 w/o Mg and Ca
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) VWR 52858-000
purified anti-human CD18 Biolegend 302102
RPMI Medium 1640 Gibco Life Technologies 61870-010
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length Ismatec SC0059
Serological Pipetts Sarstedt 861,254,025
Trypan blue Roth CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend 553706
Vedolizumab (Entyvio) Takeda

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Becker, E., Schramm, S., Binder, M., Allner, C., Wiendl, M., Neufert, C., Atreya, I., Neurath, M., Zundler, S. Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease. J. Vis. Exp. (139), e58210, doi:10.3791/58210 (2018).

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