Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire
Summary
Dynamique adhérence de cellules immunitaires vers la paroi du vaisseau est une condition préalable pour la domiciliation de l’intestin. Nous présentons ici un protocole pour une analyse fonctionnelle in vitro pour l’analyse de l’impact des anticorps anti-intégrine, chimiokines ou d’autres facteurs sur l’adhérence cellulaire dynamique de cellules humaines à l’aide d’enduit de loopbackDans capillaires.
Abstract
Tube digestif homing des cellules immunitaires est important pour la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Adhérence cellulaire intégrine dépendant d’addressins est une étape cruciale dans ce processus et stratégies thérapeutiques interférant avec l’adhérence ont été établis avec succès. L’anticorps de l’intégrine anti-α4β7, vedolizumab, est utilisé pour le traitement clinique de la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) et autres composés sont susceptibles de suivre.
Les détails de la procédure d’adhésion et les mécanismes d’action des anticorps anti-intégrine sont encore peu clairs à bien des égards en raison des techniques limitées disponibles pour la recherche fonctionnelle dans ce domaine.
Nous présentons ici un essai d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle de l’adhérence de cellules humaines dans des conditions de circulation et de l’impact des thérapies anti-intégrine dans le contexte des MICI. Il repose sur la perfusion des cellules humaines primaires par l’intermédiaire de capillaires en verre ultrafin rence-enduit avec analyse microscopique en temps réel. Le test offre une variété de possibilités d’améliorations et modifications et détient le potentiel de découvertes mécanistes et applications translationnelles.
Introduction
Motion de la cellule est un processus fortement réglementé indispensable pour le développement et le fonctionnement des organismes multicellulaires, mais est également impliquée dans la pathogénie d’une multitude de maladies1. Récemment, le processus de retour des cellules immunitaires dans la circulation sanguine vers les tissus périphériques a gagné une attention croissante, car il contribue à la reconstitution et l’expansion des cellules pathogènes dans les tissus enflammés dans les maladies à médiation immunologique par2 ,3. En particulier, homing s’est avéré ont intérêt translationnelle dans les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). La thérapeutique anti-α4β7 intégrine anticorps vedolizumab interférant avec homing gut a montré une efficacité dans des essais cliniques à grande échelle4,5 et a été utilisé avec succès dans la pratique clinique réelle6,7 , 8. autres composés sont susceptibles de suivre9,10. De même, l’anticorps de l’intégrine thérapeutique anti-α4, natalizumab, est utilisé pour le traitement de la sclérose en plaques (MS)11.
Toutefois, notre compréhension fonctionnelle du processus contrechamp en général et le mécanisme d’action de ces anticorps thérapeutiques en particulier est encore limitée. Il est bien établi que homing consiste en plusieurs étapes, y compris la cellule attachant et roulant avec adhérence de cellules suivantes conduisant à l’arrestation ferme suivie de trans migration endothéliales12,13. Les anticorps susmentionnés neutralisent des intégrines à la surface cellulaire empêchant l’interaction avec les addressins sur l’endothélium de la paroi des vaisseaux. Ceci est pensé pour empêcher la cellule ferme adhésion14,15. Pourtant, nous commençons seulement à comprendre la pertinence différentielle des intégrines spécifiques pour la domiciliation de cellule de sous-ensembles distincts de cellules. En outre, les effets des anticorps anti-intégrine sur différents sous-ensembles de cellules et les associations de dose-réponse sont largement méconnues, menant à beaucoup de questions en suspens dans le domaine des thérapies de radioralliement et contre les adhérences intestinale dans les MICI.
Par conséquent, des outils pratiques pour répondre à ces questions sont absolument nécessaires. L’effet des anticorps anti-intégrine sur l’interaction de l’intégrine-rence a jusqu’ici surtout été évalué en évaluant l’inhibition de l’efficacité/liaison liaison avec écoulement cytometry ou par adhérence statique dosages16,17 ,19,18,20, donc avec la simplification apparente et l’écart par rapport à la situation physiologique. Nous avons récemment mis en place un test d’adhérence dynamiques pour étudier l’adhésion intégrine-dépendante des cellules humaines à addressins et les effets des anticorps anti-intégrine sous la contrainte de cisaillement2. Le principe de la technique a été montré plus haut avec la souris les cellules21,22. Ici, il a été adapté et développé pour répondre aux questions mentionnées ci-dessus translationnelles, ouverture nouvelles avenues afin de mieux comprennent les mécanismes du traitement avec des anticorps anti-intégrine in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole ci-dessus décrit une technique utile pour étudier la dynamique adhérence de cellules immunitaires humaines aux ligands endothéliales. Par variation de ligands enduits types cellulaires perfusé ou sous-ensembles, incubation avec des stimuli additionnels ou différents anticorps neutralisants, il a presque illimité d’applications potentielles. Par conséquent, ces tests d’adhérence dynamique peuvent être utiles de répondre à deux questions fondamentales de recherche fondamentale et translationnel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche du CN, IA, traitement NPF et SZ a été appuyée par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) et le programme ELAN de l’université Erlangen-Nuremberg, l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, la maladie de Crohn allemand et Colitis Foundation (DCCV), la clinique recherche groupe CEDER du Conseil allemand de la recherche (DFG), le programme de rubrique DFG microbiote, l’Initiative de champ émergeant et le DFG Collaborative Research Centers 643, 796 et 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
Riferimenti
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