Summary

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Published: September 20, 2018
doi:

Summary

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Gut posta bağışıklık hücrelerinin inflamatuvar barsak hastalıkları (IBD) patogenezinde için önemlidir. Integrin bağımlı hücre adezyon addressins için bu süreçte önemli bir adımdır ve tedavi stratejileri ile yapışma müdahale başarıyla kurulmuştur. Anti-α4β7 integrin antikor, vedolizumab, Crohn hastalığı (CD) klinik tedavisi için kullanılır ve ülseratif kolit (UC) ve daha fazla bileşikler takip etmek olasıdır.

Yapışma yordamı ayrıntılarını ve anti-integrin antikorlar eylem mekanizmaları hala bu alanda fonksiyonel araştırma için sınırlı kullanılabilir teknikleri nedeniyle birçok bakımdan pek açık değildir.

Burada, IBD bağlamında insan hücre adezyon akışı koşullar altında fonksiyonel analiz ve anti-integrin tedavilerin etkisi için bir dinamik yapışma tahlil mevcut. Gerçek zamanlı mikroskobik analizi ile ultrathin cam kaplı isteyebileğinizi kılcal damarlar ile birincil insan hücreleri perfüzyon dayanmaktadır. Tahlil iyileştirmeler ve değişiklikler için fırsatlar sunar ve potansiyelleri mekanik keşifler ve çevirim uygulamalar için tutar.

Introduction

Hücre hareket vazgeçilmez geliştirme ve işlevi çok hücreli organizmalar için sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir ama aynı zamanda çok sayıda hastalıkları1patogenezinde karıştığı. Stok yenileme ve genişletme iltihaplı dokulara immunologically aracılı hastalıkları2 patojen hücrelerinin katkıda beri son zamanlarda artan ilgi, periferik dokulara kan akışından bağışıklık hücreleri izleme sürecinin kazanmıştır ,3. Özellikle, posta iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD) translasyonel yakınlık derecesine sahip olduğu gösterilmiştir. Gut posta ile müdahale tedavi anti-α4β7 integrin antikor vedolizumab etkinliği büyük klinik çalışmalarda4,5 ‘ te gösterilen ve gerçek klinik pratikte6,7 ‘ başarılı bir şekilde kullanılmıştır , 8. daha fazla bileşikler9,10izleyin muhtemeldir. Benzer şekilde, tedavi anti-α4 integrin antikor, natalizumab, multipl skleroz (MS)11tedavisi için kullanılır.

Ancak, bizim işlevsel izleme süreci genel olarak anlama ve bu tür tedavi antikorların etki mekanizması özellikle hala sınırlı. İyi posta hücre hayvan zinciri ve sağlam tutuklama trans endotel geçiş12,13tarafından takip önde gelen sonraki hücre adezyon ile çalışırken de dahil olmak üzere birkaç adımdan oluşan kuruldu. Yukarıda bahsedilen antikorlar integrinler damar duvarının addressins üzerinde endotel ile etkileşimi engelleyen hücre yüzeyinde etkisiz hale getirin. Bu firma hücre adezyon14,15engel düşünülmektedir. Henüz, biz sadece hücre posta, farklı hücre alt kümeleri için belirli integrinler fark uygunluğunu anlamaya başlıyor. Ayrıca, farklı anti-integrin antikorlar etkisi alt kümeleri hücre ve bir sürü açık soru IBD gut izleme ve anti-yapışma tedaviler alanında önde gelen büyük ölçüde bilinmeyen doz-yanıt ilişkilerdir.

Bu nedenle, bu tür soruları çözmek için uygun araçlar umutsuzca ihtiyaç vardır. Anti-integrin antikorlar etkisi integrin isteyebileğinizi etkileşim defa ağırlıklı olarak bağlama etkinliği/bağlama inhibisyon veya statik yapışma deneyleri16,17 akış sitometresi ile değerlendirilmesi tarafından değerlendirilmiştir ,18,19,20, böylece bariz basitleştirilmesi ve fizyolojik durum sapma ile. Biz son zamanlarda insan addressins hücrelere integrin bağımlı yapışma ve anti-integrin antikorlar altında kesme stres2etkileri çalışmaya dinamik yapışma tahlil kurulmuş. Teknik prensibi daha önce fare hücreleri21,22ile göstermiştir. Burada, bu uyarlanmış ve yukarıda belirtilen çevirim sorulara yönelik olarak geliştirilen, mekanizmaları ile anti-integrin antikorlar vivo içindetedavisinin açılış roman caddeleri için daha iyi anlıyorum.

Protocol

Aşağıdaki bölümlerde açıklanan çalışmalar Etik Komitesi Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg onayı göre gerçekleştirilmiş. 1. kılcal hazırlanması Dikdörtgen kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle (yaklaşık 0.5 cm) kılcal tüp içine ekleme tarafından alıpkendi için bağlayın. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın. İsteyebileğinizi (rekombinant Fc chimera; 5 µg/isteyebileğinizi,…

Representative Results

Yöntemi sunulan bu el yazması amacı insan hücre adezyonu endotel duvara vivo içinde süreci yakın olarak işlevsel olarak benzetimini yapmak için hücre adezyon ve müdahaleci antikorların rol değerlendirmek. Bu nedenle, ultrathin kılcal addressins ile kaplı ve perfüzyon pompa kullanarak faiz fluorescently etiketli insan hücreleri ile derin. Canlı hücre addressins için insan hücrelerinin yapışma Imaging kullanarak gerçek zamanlı (Şekil 1…

Discussion

Yukarıdaki Protokolü dinamik adezyonu endotel ligandlar için insan bağışıklık hücrelerinin çalışma için yararlı bir yöntem açıklanır. Kaplamalı ligandlar, periosteum hücre tipleri veya alt kümeleri, kuluçka ek uyaranlara veya farklı nötralize antikorlar ile varyasyon ile neredeyse var sınırsız potansiyel uygulamalar. Bu nedenle, bu tür dinamik yapışma deneyleri temel araştırma hem de geliştirmek ve klinik tedavisi ilaçlarla yapışma işlemine engel optimize etmek için yardımcı olabil…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Araştırma CN, IA, MFN ve SZ klinik araştırma (IZKF) ve Erlangen-Nürnberg Üniversitesi, başka Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Alman Crohn ELAN programı için disiplinlerarası Center tarafından desteklendi ve Kolit Vakfı (DCCV), klinik araştırma grubu CEDER, Alman Araştırma Konseyi (DFG), DFG konu programın Microbiota, ortaya çıkan alan girişimi ve DFG işbirlikçi araştırma merkezleri 643, 796 ve 1181.

Materials

48-Well plate Sarstedt 833,923
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Bovine Serum albumin (BSA) Applichem A1391,0100
CaCl2 Merck 2382
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length CM Scientific 3520-050
CCL-2, human Immunotools 11343384
CD4-Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFischer Scientific C34554
Centrifuge (Rotixa 50 RS) Hettrich
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
Confocal Microscope (TCS SP8) Leica
CXCL-10, human Immunotools 11343884
Dextran 500 Roth 9219.3
EDTA KE/9 ml Monovette Sarstedt
Falcons (50 mL) Sarstedt 62,547,004
Fc chimera isotype control R&D Systems 110-HG
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPES VWR J848-100ML
Human IgG Isotype Control ThermoFischer Scientific 31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera R&D Systems 720-IC-050
LS-Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MgCl2 Roth
MnCl2 Roth
mouse IgG isotype control Miltenyi Biotec 130-106-545
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera R&D Systems 6056-MC
NaCl Roth 3957.3
Natalizumab Biogen
Neubauer Counting chamber Roth T729.1
Pancoll, human PAN Biotech P04-601000
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Biochrom L 182-10 w/o Mg and Ca
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) VWR 52858-000
purified anti-human CD18 Biolegend 302102
RPMI Medium 1640 Gibco Life Technologies 61870-010
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length Ismatec SC0059
Serological Pipetts Sarstedt 861,254,025
Trypan blue Roth CN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera Biolegend 553706
Vedolizumab (Entyvio) Takeda

Riferimenti

  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  3. Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
  4. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
  5. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
  6. Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
  7. Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
  8. Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
  9. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  10. Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
  11. Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  13. Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
  14. Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
  15. Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  16. Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
  17. Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
  18. Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
  19. Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
  20. Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
  21. Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
  22. Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
  23. Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
  24. Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
  25. House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
  26. Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
  27. Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  28. Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  29. Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Becker, E., Schramm, S., Binder, M., Allner, C., Wiendl, M., Neufert, C., Atreya, I., Neurath, M., Zundler, S. Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease. J. Vis. Exp. (139), e58210, doi:10.3791/58210 (2018).

View Video