Dynamiska vidhäftning av immunceller till kärlväggen är en förutsättning för gut homing. Här presenterar vi ett protokoll för en funktionell i vitro assay för konsekvensbedömningen av anti-integrin antikroppar, chemokiner eller andra faktorer på den dynamiska celladhesion av mänskliga celler med hjälp av addressin-belagda kapillärer.
Gut homing av immunceller är viktig för patogenesen vid inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD). Integrin-beroende celladhesion till addressins är ett viktigt steg i denna process och terapeutiska strategier störa vidhäftning har varit framgångsrikt etablerat. Anti-α4β7-integrin antikroppen, vedolizumab, används för klinisk behandling av Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC) och ytterligare föreningar är sannolikt att följa.
Detaljerna i förfarandet för vidhäftning och verkningsmekanismer av anti-integrin antikroppar är fortfarande oklart i många avseenden på grund av de begränsa tillgängliga teknikerna för funktionell forskning på detta område.
Här presenterar vi en dynamisk vidhäftning test för den funktionella analysen av mänsklig celladhesion under flödesförhållanden och effekten av anti-integrin terapier i samband med IBD. Den är baserad på perfusionen av primära mänskliga celler genom addressin-belagda ultrathin glas kapillärer med Mikroskopisk analys i realtid. Analysen erbjuder en mängd möjligheter till förbättringar och ändringar och innehar potentialer för mekanistiska upptäckter och translationella program.
Cellrörelse är en hårt reglerad process som är oumbärlig för utveckling och funktion av flercelliga organismer, men är också inblandade i patogenesen av en mängd sjukdomar1. Nyligen, målsökande processen av immunceller från blodbanan till perifera vävnader har fått allt större uppmärksamhet, eftersom det bidrar till påfyllning och expansion av patogena celler i inflammerade vävnader i immunologiskt medierad sjukdomar2 ,3. I synnerhet har homing visat sig ha betydelse för translationell i inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD). Den terapeutiska anti-α4β7-integrin antikropp vedolizumab stör tarmen homing har visat effekt i stora kliniska prövningar4,5 och har använts framgångsrikt i verkliga kliniska praktiken6,7 , 8. ytterligare föreningar är sannolikt att följa9,10. Likaså används den terapeutiska anti-α4-integrin antikroppen, natalizumab, för behandling av multipel skleros (MS)11.
Våra funktionella förståelse av målsökande processen i allmänhet och verkningsmekanismen av dessa terapeutiska antikroppar är i synnerhet dock fortfarande begränsad. Det är väletablerat att homing består av flera steg inklusive cell tjudra och rullande med efterföljande celladhesion leder till fast gripandet följt av trans endothelial migration12,13. Ovannämnda antikropparna neutralisera integriner på cellytan förhindrar interaktion med addressins på endotelet av kärlväggen. Detta är tänkt att hindra fast cell adhesion14,15. Ändå vi bara börjar förstå differentiell relevansen av specifika integriner för cell homing av distinkta cell delmängder. Dessutom effekterna av anti-integrin antikroppar på olika cell delmängder och dos-respons föreningar är till stor del okända leder till massor av öppna frågor i fältet av gut homing och anti vidhäftning behandlingar hos IBD.
Därför behövs desperat bekvämt verktyg för att ta itu med sådana frågor. Effekten av anti-integrin antikroppar på integrin-addressin interaktion har hittills huvudsakligen utvärderats genom att bedöma bindande effekt/bindande hämning med flödescytometri eller genom statisk friktion analyser16,17 ,18,19,20, således med skenbara förenkling och avvikelse från fysiologiska situationen. Vi har nyligen etablerat en dynamisk vidhäftning analys för att studera integrin-beroende vidhäftning av mänskliga celler till addressins och effekter av anti-integrin antikroppar under skjuvspänningen2. Principen om tekniken har tidigare påvisats med musen celler21,22. Här, det var anpassad och utvecklad för att ta itu med ovan nämnda translationell frågor, öppna nya vägar att bättre förstå mekanismerna bakom behandling med anti-integrin antikroppar i vivo.
Det ovannämnda protokollet beskriver en användbar teknik för att studera dynamiska vidhäftning av mänskliga immunceller till endotelceller ligander. Genom variation av de belagda liganderna eller delmängder, inkubation med ytterligare stimuli eller olika neutraliserande antikroppar perfunderade celltyper, det har nästan obegränsade potentiella tillämpningar. Sådana dynamiska vidhäftning analyser kan därför användbar besvara både grundläggande frågor av såväl grundforskning som translationell frågor so…
The authors have nothing to disclose.
Forskning av CN, IA, MFN och SZ stöddes av tvärvetenskaplig centrum för klinisk forskning (IZKF) och ELAN programet av den universitet Erlangen-Nürnberg, den annan Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, den tyska Crohns och Kolit Foundation (DCCV), den kliniska forskning grupp CEDER av tysk forskning rådet (DFG), programmet för DFG-ämne på bakterieflora, framväxande fältet initiativ och DFG Collaborative Research Centers 643, 796 och 1181.
48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
CaCl2 | Merck | 2382 | |
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
HEPES | VWR | J848-100ML | |
Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MgCl2 | Roth | ||
MnCl2 | Roth | ||
mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
NaCl | Roth | 3957.3 | |
Natalizumab | Biogen | ||
Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |