Dynamisk vedheft av immunceller fartøyet veggen er en forutsetning for gut homing. Her presenterer vi en protokoll for en funksjonell i vitro analysen for innvirkning analyse av anti-integrin antistoffer, chemokines eller andre faktorer på dynamisk celle vedheft av menneskelige celler ved hjelp av addressin-belagt kapillærer.
Gut homing av immunceller er viktig for patogenesen av inflammatorisk tarm sykdommer (IBD). Integrin-avhengig celle vedheft til addressins er et viktig skritt i denne prosessen og strategier forstyrrer vedheft har blitt opprettet. Ulcerøs kolitt (UC) og videre forbindelser er trolig følge anti-α4β7 integrin antistoffer, vedolizumab, brukes for klinisk behandling av Crohns sykdom (CD).
Detaljer om vedheft prosedyren og handling mekanismer for anti-integrin antistoffer er fortsatt uklart i mange forhold på grunn av begrensede tilgjengelige teknikker for funksjonell forskning i dette feltet.
Her presenterer vi en dynamisk vedheft analysen for funksjonell analyse av human celle vedheft under strømningsforhold og virkningen av anti-integrin terapi i sammenheng med IBD. Den er basert på perfusjon av primære menneskelige celler gjennom addressin-belagt ultrathin glass kapillærene med sanntid mikroskopisk analyse. Analysen tilbyr en rekke muligheter for forbedringer og endringer, og har potensial for mekanistisk funn og translasjonsforskning programmer.
Cellen bevegelse er en strengt regulert prosess uunnværlig for utvikling og funksjon av multi-mobilnettet organismer, men er også innblandet i patogenesen av en rekke sykdommer1. Nylig har homing prosessen av immunceller fra blodet perifere vev fått økende oppmerksomhet, siden det bidrar til påfylling og utvidelse av patogene celler i betent vev i immunologisk mediert sykdommer2 ,3. Spesielt har homing vist å ha translasjonsforskning relevans i inflammatorisk tarm sykdommer (IBD). Den terapeutiske anti-α4β7 integrin antistoff vedolizumab forstyrrer gut homing har vist effekt i store kliniske studier4,5 og har blitt brukt i reelle klinisk praksis6,7 , 8. videre forbindelser er trolig følge9,10. Tilsvarende brukes terapeutiske anti-α4 integrin antistoffer, natalizumab, for behandling av multippel sklerose (MS)11.
Men er våre funksjonell forståelse av homing prosessen generelt og virkningsmekanismen av slike terapeutiske antistoffer spesielt fortsatt begrenset. Det er godt etablert at homing består av flere trinn inkludert celle tethering og rulle med påfølgende celleadhesjon fører til fast arrestasjonen etterfulgt av trans endothelial migrasjon12,13. Ovennevnte antistoffer nøytralisere integrins på celleoverflaten forhindrer interaksjon med addressins på endothelium av fartøyet veggen. Dette er antatt å hindre fast celle vedheft14,15. Likevel, vi bare begynner å forstå differensial relevansen av bestemte integrins for cellen homing av forskjellige celle undergrupper. Videre effekten av anti-integrin antistoffer på ulike celle delsett og dose-respons foreninger er hovedsakelig ubekjent fører til mange åpne spørsmål innen gut homing og anti-vedheft terapi i IBD.
Derfor trengte praktisk verktøy for å ta opp slike spørsmål desperat. Effekten av anti-integrin antistoffer på integrin-addressin interaksjon er så langt hovedsakelig evaluert ved å vurdere bindende effekt binding hemming flowcytometri eller gjennom statisk vedheft analyser16,17 ,18,19,20, dermed med åpenbare forenkling og avvik fra fysiologiske situasjonen. Vi har nylig etablert en dynamisk vedheft analysen for å studere integrin-avhengige vedheft av menneskelige celler til addressins og effekten av anti-integrin antistoffer under skjæring stress2. Prinsippet om teknikken har tidligere blitt demonstrert med musen celler21,22. Her var tilpasset og utviklet for å håndtere de ovennevnte translasjonsforskning spørsmålene, åpning romanen veier for å bedre forstå mekanismene terapi med anti-integrin antistoffer i vivo.
Over protokollen beskriver en nyttig teknikk for å studere dynamisk vedheft av menneskelig immunceller endothelial ligander. Gjennom variasjon belagt ligander, parfyme celletyper eller delsett, inkubasjon med ekstra stimuli eller annen nøytraliserende antistoffer, har det nesten ubegrenset bruksmuligheter. Derfor kan slik dynamisk vedheft analyser være nyttig å svare både grunnleggende spørsmål om grunnleggende forskning samt translasjonsforskning spørringer som kan bidra til å utvikle og optimalisere kliniske m…
The authors have nothing to disclose.
Forskning av CN, IA, MFN og SZ ble støttet av tverrfaglig senter for klinisk forskning (IZKF) og ELAN programmet University Erlangen-Nuremberg, den andre Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, tysk Crohns og Kolitt Foundation (DCCV), klinisk forskning gruppe CEDER av tysk Research Council (DFG), programmet DFG emnet på bakterieflora, nye feltet initiativ og den DFG samarbeidende forskning sentre 643, 796 og 1181.
48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
CaCl2 | Merck | 2382 | |
Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
HEPES | VWR | J848-100ML | |
Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MgCl2 | Roth | ||
MnCl2 | Roth | ||
mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
NaCl | Roth | 3957.3 | |
Natalizumab | Biogen | ||
Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |