Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie
Summary
Dinamica adesione delle cellule immuni alla parete del vaso è un prerequisito per homing gut. Qui, presentiamo un protocollo per un’analisi funzionale in vitro per l’analisi dell’impatto degli anticorpi anti-integrina, chemochine o altri fattori sull’adesione di dinamica delle cellule delle cellule umane utilizzando capillari α4β7 rivestite.
Abstract
Gut homing delle cellule del sistema immunitario è importante per la patogenesi delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Adesione di integrina-dipendente delle cellule di addressins è un passo fondamentale in questo processo e interferire con l’adesione di strategie terapeutiche sono state stabilite con successo. L’anticorpo di anti-α4β7 integrina, vedolizumab, è utilizzato per il trattamento clinico del morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) e altri composti sono propensi a seguire.
I dettagli della procedura di adesione e i meccanismi di azione degli anticorpi anti-integrina sono ancora poco chiari per quanto riguarda molti a causa delle limitate tecniche disponibili per la ricerca funzionale in questo campo.
Qui, presentiamo un saggio di adesione dinamico per l’analisi funzionale di adesione delle cellule umane in condizioni di flusso e l’impatto delle terapie anti-integrina nel contesto di IBD. Si basa sull’aspersione di cellule umane primarie attraverso capillari di vetro ultrasottile α4β7 rivestite con l’analisi al microscopio in tempo reale. Il saggio offre una varietà di opportunità per modifiche e perfezionamenti e detiene potenzialità per applicazioni traslazionale e meccanicistici scoperte.
Introduction
Movimento delle cellule è un processo strettamente regolato indispensabile per lo sviluppo e la funzione degli organismi pluricellulari, ma inoltre è implicata nella patogenesi di una moltitudine di malattie1. Recentemente, il processo di homing delle cellule immuni dal flusso sanguigno ai tessuti periferici ha guadagnato l’attenzione aumentante, poiché contribuisce al rifornimento e all’espansione delle cellule patogene in tessuti infiammati in malattie immunologicamente mediate2 ,3. In particolare, l’homing ha dimostrato di avere rilevanza traslazionale in malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD). Il terapeutico anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferire con homing gut ha indicato l’efficacia in studi clinici di grandi4,5 ed è stato utilizzato con successo nel mondo reale pratica clinica6,7 , 8. ulteriori composti sono propensi a seguire9,10. Allo stesso modo, l’anticorpo di integrina terapeutico anti-α4, natalizumab, è utilizzato per il trattamento della sclerosi multipla (MS)11.
Tuttavia, la nostra comprensione funzionale del processo di homing in generale e il meccanismo di azione di tali anticorpi terapeutici in particolare è ancora limitato. È assodato che homing è costituito da diversi passaggi tra cui cella tethering e rotolamento con adesione successiva delle cellule che conduce all’arresto costante seguita da trans migrazione endoteliale12,13. I suddetti anticorpi neutralizzano le integrine sulla superficie delle cellule impedendo l’interazione con addressins sull’endotelio della parete del vaso. Questo è pensato per impedire cella ferma adesione14,15. Eppure, stiamo solo cominciando a capire la rilevanza differenziale delle integrine specifiche per homing delle cellule dei sottogruppi distinti delle cellule. Inoltre, gli effetti degli anticorpi anti-integrina su diversi sottoinsiemi del cellulare e associazioni di dose-risposta sono in gran parte sconosciute che conduce a un sacco di domande aperte nel campo delle terapie di homing e anti-adesione di intestino in IBD.
Pertanto, strumenti utili per affrontare tali questioni sono disperatamente necessari. L’effetto degli anticorpi anti-integrina sull’interazione integrina α4β7 finora è stata valutata principalmente valutando l’inibizione di efficacia/associazione associazione con citometria a flusso o tramite adesione statica saggi16,17 ,19,18,20, così con apparente semplificazione e deviazione dalla situazione fisiologica. Recentemente abbiamo stabilito un’analisi di adesione dinamico per studiare l’adesione integrine-dipendente delle cellule umane per addressins e gli effetti degli anticorpi anti-integrina sotto sollecitazione di taglio2. Il principio della tecnica è stato dimostrato in precedenza con mouse cellule21,22. Qui, si era adattato e sviluppato per affrontare le questioni di cui sopra traslazionale, apertura nuovi viali per meglio comprendere i meccanismi della terapia con anticorpi anti-integrina in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive una tecnica utile per studiare la dinamica adesione delle cellule immuni umane a ligandi endoteliali. Attraverso la variazione di ligandi rivestiti, tipi cellulari irrorato o sottoinsiemi, incubazione con stimoli ulteriori o diversi anticorpi neutralizzanti, ha quasi illimitato di potenziali applicazioni. Pertanto, tali dosaggi di adesione dinamica possono essere utile per rispondere a entrambe le domande fondamentali della ricerca di base, nonché query traslazionale che potrebbe cont…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca di CN, IA, MFN e SZ è stata sostenuta dal centro interdisciplinare per ricerca clinica (IZKF) e il programma ELAN dell’Università di Erlangen-Norimberga, l’altro Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung di Crohn tedesco e Colite Foundation (DCCV), la clinica ricerca gruppo CEDER di Consiglio di ricerca tedesca (DFG), il programma di argomento DFG sul Microbiota, l’iniziativa di campo emergente ed il DFG Collaborative Research centri 643, 796 e 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
Riferimenti
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
